PKC抑制劑SP及激活劑PMA影響DEV增殖研究.pdf

1、鴨腸炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)又稱鴨瘟病毒(Duck plague virus，DPV)，是阻礙養(yǎng)鴨業(yè)健康發(fā)展的重要病原之一。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)了 DEV核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein，NP)及其宿主細(xì)胞受體即蛋白激酶C抑制蛋白(Protein kinase C inhibitor，PKCI)。PKCI是宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)的抑制蛋白質(zhì)，

2、PKC是宿主細(xì)胞磷酸化通路的關(guān)鍵分子，參與多種病毒的增殖過(guò)程。但宿主細(xì)胞磷酸化通路是否影響DEV侵染過(guò)程，尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本研究利用PKC經(jīng)典抑制劑(Staurosporine，SP)和專性激活劑(Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)開(kāi)展磷酸化通路在DEV感染中的作用研究，以期為闡明DEV侵染機(jī)理提供一些新的線索和思路。
　　1．鴨源PKC基因熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立：根據(jù)GenBank

3、上PKC基因設(shè)計(jì)和合成特異性引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增從鴨胚成纖維(DEF)細(xì)胞mRNA提取樣本中獲取目的基因片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒GV pXT19-T-PKC，并以其為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品建立熒光定量PCR檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后進(jìn)行重復(fù)性、特異性和敏感性驗(yàn)證，結(jié)果顯示：熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系為Y=-3.3340x+44.199，相關(guān)系數(shù)為0.9954，擴(kuò)增效率為99.19％；熔解曲線僅出現(xiàn)單特異峰，對(duì)H5亞型AIV、H7亞型AIV、H9亞型A

4、IV、NDV和DHV均未檢測(cè)到熒光信號(hào)。這表明本試驗(yàn)建立的熒光定量PCR方法具有良好的穩(wěn)定性、特異性和靈敏性。
　　2．SP和PMA對(duì)DEV毒力的影響：取DEV貴州強(qiáng)毒株，接種DEF細(xì)胞，測(cè)定TCID50值；取培養(yǎng)成單層的DEF細(xì)胞，分別用SP和PMA(濃度均為100nmol/L)處理4h，分別加入系列稀釋的DEV進(jìn)行孵育，觀察和測(cè)定TCID50值變化；分別以不同濃度的SP和PMA處理DEF細(xì)胞后，再加入0.01MOI的DEV進(jìn)行

5、孵育，觀察和分析病毒TCID50值變化，結(jié)果：DEV貴州強(qiáng)毒株的TCID50值為3.16×10-9/0.1mL；經(jīng)SP處理，隨處理濃度的加大，病毒TCID50值隨之下降，但濃度到100nmol/L時(shí)，病毒TCID50值回升；經(jīng)PMA處理，在20至50nmol/L時(shí)病毒TCID50值隨之上升，但到100至200nmol/L時(shí)，病毒TCID50值反而下降。這表明經(jīng)SP和PMA處理，可影響DEV毒力即DEV的增殖。
　　3．SP和PMA

6、對(duì)PKC、PKCI和DEV-NP基因轉(zhuǎn)錄的影響：取培養(yǎng)成單層的DEF細(xì)胞，經(jīng)SP和PMA處理后，再用DEV感染，然后收集細(xì)胞培養(yǎng)物，應(yīng)用前期建立的熒光定量PCR方法檢測(cè)分析PKC、PKCI和DEV-NP基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果：SP處理組PKC、PKCI和DEV-NP基因的轉(zhuǎn)錄水平分別為2.62×109 copies/μL、2.61×102 copies/μL和6.65×100 copies/μL；PMA處理組相應(yīng)為3.92×108 cop