自噬激活劑-抑制劑對小鼠神經(jīng)干細胞增殖和分化潛能的影響.pdf

1、目的：觀察自噬水平改變對新生和成年小鼠神經(jīng)干細胞（Neural Stem Cells，NSCs）增殖和分化能力的影響，明確激活自噬對成體NSCs功能維持的保護作用，探討維持干細胞活力的有效途徑。
　　方法：⑴分離培養(yǎng)新生（Postnatal day0，P0）小鼠室管膜下區(qū)（subventricularzone，SVZ） NSCs，應(yīng)用自噬抑制劑Ly294002干預(yù)P0 NSCs，LC3免疫熒光染色觀察細胞中自噬小體的變化，并且通過

2、BrdU摻入實驗檢測抑制自噬對P0 NSCs增殖能力的影響。用分化培養(yǎng)基誘導P0 NSCs分化，western blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3II和p62在NSCs分化過程中的表達變化。應(yīng)用Ly294002作用于分化的P0 NSCs，Tuj1免疫熒光染色檢測早期神經(jīng)元標記物的表達變化。⑵分離培養(yǎng)成年（Postnatal days90，P90）小鼠SVZ區(qū) NSCs，應(yīng)用自噬激活劑Rapamycin作用于P90 NSCs，采用LC3免疫熒

3、光染色檢測自噬水平。隨后通過BrdU摻入實驗和Tuj1免疫熒光染色分析激活自噬對P90 NSCs增殖和分化能力的影響。⑶成年小鼠腹腔注射自噬激活劑Rapamycin（4mg/kg），隔日一次，共14天，提取SVZ蛋白檢測Rapamycin靶蛋白mTOR的磷酸化水平。同時制備腦片通過Ki67和DCX免疫熒光染色觀察激活自噬對成年小鼠SVZ區(qū)NSCs增殖和分化能力的影響。
　　結(jié)果：①應(yīng)用自噬抑制劑Ly294002作用于P0 NSCs

4、3d，LC3免疫熒光染色結(jié)果顯示NSCs中自噬小體明顯減少，提示Ly294002能夠抑制P0 NSCs自噬發(fā)生，但免疫熒光染色顯示Ly294002組與DMSO組BrdU陽性率無顯著差異。P0 NSCs分化后LC3II的蛋白含量較分化前升高1.0±0.4倍(p<0.05)，p62的蛋白含量較未分化組降低了0.5±0.1倍(p<0.01)，表明自噬參與調(diào)控 NSCs的分化過程。應(yīng)用5μM和10μM Ly294002作用于P0 NSCs，降低

5、細胞自噬水平后，則Ly294002組Tuj1的陽性率分別較對照組顯著降低了0.6和0.7倍(p<0.01)，提示降低自噬水平，抑制P0 NSCs向神經(jīng)元方向分化。②應(yīng)用自噬激活劑Rapamycin作用于P90 NSCs，LC3免疫熒光染色結(jié)果顯示NSCs中自噬小體增加，提示Rapamycin提高P90 NSCs的自噬水平，并且免疫熒光染色顯示Rapamycin組BrdU陽性率分別為25.4％±6.0%和26.2%±6.7%較對照組12.

6、0%±0.8%明顯升高(p<0.05)，表明激活自噬可以促進P90 NSCs增殖。應(yīng)用20nM和50nM Rapamycin作用于P90 NSCs，NSCs誘導分化3d后，則Rapamycin組Tuj1的陽性率分別較對照組升高了1.5倍和1.3倍，(p<0.01)，提示提高自噬水平，促進P90 NSCs向神經(jīng)元方向分化。③成年小鼠腹腔注射Rapamycin，Rapamycin組mTOR的磷酸化水平較對照組降低了34.0%±8.6%(p<

7、0.01)，表明腹腔注射Rapamycin后能夠抑制mTOR激活自噬，免疫熒光染色顯示，Rapamycin組Ki67陽性細胞數(shù)為98.9±8.1較DMSO組61.15±8.56明顯升高(p<0.05)，早期神經(jīng)元標記物DCX陽性數(shù)是對照組的1.5倍(p<0.01)，表明提高成年小鼠腦內(nèi)SVZ區(qū)的自噬水平，可以提高NSCs增殖和分化潛能。
　　結(jié)論：自噬參與小鼠NSCs功能維持，改變自噬水平能夠影響NSCs的增殖和分化。應(yīng)用自噬激活