骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外向胰島樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、全文分為二部分： 第一部分 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定 背景與目的：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是存在于骨髓中的一種具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞。研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以向內(nèi)胚層、中胚層和外胚層組織細(xì)胞分化，如肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和胰島素分泌細(xì)胞等。本研究旨在體外分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，觀察BMSCs的生物學(xué)特性，并采用流式細(xì)胞檢測技術(shù)鑒定BMSCs。為進(jìn)一步觀察體外BM

2、SCs向胰島素分泌細(xì)胞分化奠定基礎(chǔ)。 材料與方法：Wister大鼠麻醉致死后，無菌條件下取出脛骨和股骨用L-DMEM培養(yǎng)基從骨腔一端沖洗骨髓腔，沖出骨髓，輕柔充分吹打成單細(xì)胞懸液，離心洗滌后，所得細(xì)胞按1×10<'8>/mL密度接種于25cm<'2>塑料培養(yǎng)瓶中，37℃，5％CO<,2>，飽和濕度下培養(yǎng)48小時，首次更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁細(xì)胞，此后每2-3天換液1次，觀察細(xì)胞形態(tài)變化。待細(xì)胞生長良好，80％融合后，傳代培養(yǎng)。取第

3、3或4代細(xì)胞做流式細(xì)胞檢測，檢測獲得的貼壁細(xì)胞表面標(biāo)記抗原CD29、CD90和CD45表達(dá)情況。 結(jié)果：在最初培養(yǎng)的48h內(nèi)，可見大量圓形細(xì)胞，懸浮生長。48h后可見部分細(xì)胞呈貼壁生長。至第5天時，隨著換液次數(shù)的增加，圓形懸浮細(xì)胞逐漸減少，貼壁細(xì)胞明顯增多，呈聚集樣生長，細(xì)胞形態(tài)呈梭形和多角形。約10-14天后細(xì)胞鋪滿瓶底，呈魚叢狀或漩渦狀聚集，細(xì)胞形態(tài)呈梭形。流式細(xì)胞方法檢測大鼠BMSCs的表面標(biāo)記抗原。結(jié)果顯示： 第

4、三代大鼠BMSCs的特異性表面標(biāo)志物：CD29陽性，陽性率為91.9％；CD45陰性，陽性率為6.9％；CD29/CD45陽性率為7.4％；CD90陽性，陽性率為51.3％；CD90/CD45陽性率為3.6％。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)通過貼壁篩選法和全骨髓培養(yǎng)法成功分離培養(yǎng)了大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 第二部分 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化 目的：探討聯(lián)合應(yīng)用高糖和GLP-1、活化素A、尼克酰胺和β細(xì)胞調(diào)節(jié)素刺激

5、體外能否誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化。 材料與方法：體外培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，待細(xì)胞80％融合時，用0．1％胰蛋白酶消化傳代，按2×10<'5>/ml接種于96孔板。觀察細(xì)胞生長情況。采用以下誘導(dǎo)刺激方案：先給予23mmol/L高葡萄糖刺激約20天，接著再將刺激后細(xì)胞分為7組，分別給予不同的刺激條件：A組：23mmol/L高葡萄糖培養(yǎng)基刺激；B組：L-DMEM培養(yǎng)基中加GLP-1，終濃度為5nmol/L；C組：L-D

6、MEM培養(yǎng)基中加活化素A，終濃度為10mg/ml；D組：L-DMEM培養(yǎng)基中加尼克酰胺，終濃度為10mmol/L；E組：L--DMEM培養(yǎng)基中加GLP-1+活化素A+尼克酰胺+BTC刺激因子協(xié)同作用；F組：L-DMEM培養(yǎng)基中加β細(xì)胞調(diào)節(jié)素，終濃度為10ng/ml；G組為普通L--DMEM培養(yǎng)基，設(shè)為對照組。在不同的刺激條件下，培養(yǎng)細(xì)胞16天，每2～3天更換細(xì)胞培養(yǎng)液1次，待細(xì)胞鋪滿瓶底，80％融合時傳代，制備細(xì)胞爬片。用放射免疫法檢測

7、細(xì)胞培養(yǎng)基中的胰島素水平。RT-PCR檢測各刺激組細(xì)胞胰島素mRNA的表達(dá)水平。免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測各刺激組細(xì)胞胰島素、胰高血糖素、生長抑素和巢蛋白的表達(dá)。檢測誘導(dǎo)分化后細(xì)胞對高葡萄糖刺激的胰島素釋放實(shí)驗(yàn)。將誘導(dǎo)分化后細(xì)胞按3×10<'5>/孔密度接種于24孔培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)過夜。第二天，收集舊的培養(yǎng)基后，PBS洗滌細(xì)胞3次，新鮮L-DMEMlml，培養(yǎng)1小時，再給予23mmol/L高葡萄糖培養(yǎng)基刺激細(xì)胞2小時，分別于0分、30分、

8、1h、2h收集培養(yǎng)基，放射免疫法檢測胰島素分泌水平。胰蛋白酶消化、收集細(xì)胞后，將收集的細(xì)胞加入酸酒精中，-20℃過夜，次日用細(xì)胞超聲破碎儀破碎細(xì)胞，取上清檢測胰島素濃度?？捡R斯亮蘭法測定細(xì)胞內(nèi)總蛋白濃度。 結(jié)果： 1. 誘導(dǎo)分化前hBMSCs呈貼壁生長，細(xì)胞透明，呈梭形或多邊形，魚叢狀或漩渦狀聚集生長。未給予任何刺激前人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中(細(xì)胞密度為1.0×10<'6>/ml)胰島素水平為2.2867±0.2665

9、 μU/ml。放射免疫法檢測普通L—DMEM培養(yǎng)基中胰島素水平為2.3650±0.4296μ U/ml(空白對照，本底值)。該兩組間的T檢驗(yàn)，P值為0.359>0.05，兩組間胰島素水平無顯著性差異。 2.給予23mmol/L高葡萄糖刺激刺激20天，再將上述步驟得到的細(xì)胞分為不同的7個刺激組，16天后收集細(xì)胞培養(yǎng)基，檢測胰島素分泌水平，發(fā)現(xiàn)23mmol/L高糖組、GLP-1組、活化素A組、尼克酰胺組、協(xié)同作用組、BTC組和普通L

10、-DMEM組胰島素分泌水平與刺激前hBMSCs細(xì)胞培養(yǎng)基(胰島素分泌量為2.2867±0.2665 μ U/10<'6> cells和/ml)相比，分別增加了3.13、3.00、2.35、2.94、2.84、3.22和2.32倍。協(xié)同作用并沒有顯著增加胰島素分泌量。 3.RT-PCR檢測胰島素mRNA水平發(fā)現(xiàn)：GLP-1組和活化素A組可見清晰的胰島素PCR產(chǎn)物目的片段。協(xié)同作用組和BTC組分別在900bp和300bp位置見到特異

11、性條帶，而且900bp片段較300bp片段清晰。900bp的未知片段經(jīng)測序后，發(fā)現(xiàn)其與人胰島素原基因相比較有較多的突變，故未能證實(shí)該未知片段的性質(zhì)。尼克酰胺組隱約可見300bp胰島素目的片段，但條帶亮度太低。高糖組和普通L-DMEM組均未見到胰島素目的片段。 4.免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí)除了高糖+普通L-DMEM培養(yǎng)基外，各刺激組均有胰島素表達(dá)；各刺激組均未表達(dá)胰高血糖素；除協(xié)同作用組有生長抑素的弱陽性表達(dá)外，其它各刺激組均未表達(dá)生長抑

12、素；尼克酰胺組和協(xié)同作用組可見到巢蛋白的弱陽性表達(dá)，其余各刺激組均未表達(dá)巢蛋白。 5．高糖刺激胰島素釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，經(jīng)聯(lián)合高糖和GLP-1、活化素A、BTC、尼克酰胺和共同刺激誘導(dǎo)分化后，BMSCs對高葡萄糖刺激有反應(yīng)，能相應(yīng)增加胰島素的分泌量；6．細(xì)胞內(nèi)胰島素濃度以活化素A組、BTC組和高糖+普通L-DMEM組最高，其它各刺激組細(xì)胞內(nèi)胰島素濃度較低。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用高糖和GLP-1、活化素A、尼克酰胺、BTC等刺激因