體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞研究.pdf

1、目的：對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)進(jìn)行分離培養(yǎng)和體外傳代擴(kuò)增，并分離大鼠的胰島細(xì)胞，利用大鼠胰島細(xì)胞的微環(huán)境，通過(guò)共培養(yǎng)體系誘導(dǎo)hUC-MSCs向胰島樣細(xì)胞初步轉(zhuǎn)化，探索hUC-MSCs在體外胰島細(xì)胞的微環(huán)境中向胰島樣細(xì)胞的分化潛能及功能變化趨勢(shì)。
　　 方法：
　　 1.無(wú)菌條件下取足月剖宮產(chǎn)胎兒臍帶（獲得家屬知情同意）

2、，自兩根臍動(dòng)脈間沿血管長(zhǎng)軸剪開臍帶被膜，去掉血管，采用組織塊貼壁培養(yǎng)法從人臍帶Wharton's Jelly中分離培養(yǎng)MSCs，倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)變化；傳代擴(kuò)增后經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定CD34抗體、CD45抗體、CD14抗體、CD29抗體、CD44抗體及CD105抗體的表達(dá)；
　　 2.采用膠原酶原位灌注消化法和濾網(wǎng)過(guò)濾法分離大鼠胰島細(xì)胞，特異性的雙硫腙( Dithizon，DTZ)染色進(jìn)行鑒定；
　　 3.選取狀態(tài)良好的

3、第3代或第4代hUC-MSCs，以1×105/ml接種于6孔Transwell板的底層（共培養(yǎng)組）和普通6孔培養(yǎng)板（單純培養(yǎng)組），倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁后，將分離獲得的大鼠胰島細(xì)胞團(tuán)以50個(gè)/孔接種于Transwell共培養(yǎng)板的insert中，通過(guò)共培養(yǎng)體系對(duì)hUC-MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化，倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)過(guò)程中hUC-MSCs的形態(tài)變化；免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定誘導(dǎo)后hUC-MSCs的胰島細(xì)胞早期標(biāo)志即胰十二指腸同源框-1基因( Pan

4、creatic Duodenal Homeobox-1，PDX-1)的表達(dá)；放免法定量檢測(cè)單純培養(yǎng)組和共培養(yǎng)組細(xì)胞的胰島素及C肽分泌水平，觀察兩組細(xì)胞的胰島素分泌功能變化趨勢(shì)及對(duì)葡萄糖刺激實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)性。
　　 結(jié)果：
　　 1.利用組織塊貼壁培養(yǎng)法從人臍帶Wharton's Jelly中分離出的貼壁細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察，7天左右可見組織塊周圍出現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)的短棒狀或梭形樣細(xì)胞，14天左右細(xì)胞形態(tài)變?yōu)榫坏拈L(zhǎng)梭形，20天左

5、右達(dá)70-80％融合，可進(jìn)行傳代擴(kuò)增培養(yǎng)，傳代后細(xì)胞形態(tài)類似成纖維細(xì)胞，呈平行排列生長(zhǎng)或旋渦狀生長(zhǎng)；細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第3代，流式細(xì)胞學(xué)鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志，結(jié)果高表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞的相關(guān)表面標(biāo)志(CD29、CD44、CD105)，幾乎不表達(dá)與造血細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)志(CD34、CD45、CD14);細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第10代，仍然穩(wěn)定保持著MSCs的特性。
　　 2.每只體重為250-300g的正常SD大鼠，其胰腺組織經(jīng)膠原酶原位灌注消化及

6、濾網(wǎng)過(guò)濾分離后可獲得300個(gè)左右的胰島細(xì)胞團(tuán)，DTZ染色呈棕紅色：
　　 3.倒置顯微鏡下觀察，共培養(yǎng)組hUC-MSCs誘導(dǎo)至第3天時(shí)，細(xì)胞周邊突起縮短，形態(tài)逐漸變?yōu)闄E圓形，誘導(dǎo)至第7天時(shí)，可見散在的半懸浮生長(zhǎng)的胰島樣細(xì)胞團(tuán)，雙硫腙染色呈棕紅色，誘導(dǎo)至第10天左右，胰島樣細(xì)胞團(tuán)體積變小，形態(tài)變得松散不規(guī)則，誘導(dǎo)至第14天時(shí)，胰島樣細(xì)胞團(tuán)數(shù)量減少，體積進(jìn)一步縮小。單純培養(yǎng)組的hUC-MSCs在培養(yǎng)過(guò)程中形態(tài)無(wú)明顯變化，仍呈長(zhǎng)梭形生

7、長(zhǎng)；
　　 4共培養(yǎng)組誘導(dǎo)至第3天和第7天時(shí)，胰島樣細(xì)胞經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，胰島細(xì)胞早期標(biāo)志PDX-1表達(dá)陽(yáng)性，誘導(dǎo)至第10天和第14天的胰島樣細(xì)胞，PDX-1陽(yáng)性細(xì)胞罕見。單純培養(yǎng)組PDX-1表達(dá)陰性；
　　 5采用放免法在共培養(yǎng)組的培養(yǎng)上清中檢測(cè)到較高水平的胰島素及C肽分泌，單純培養(yǎng)組檢測(cè)到少量的胰島素，幾乎檢測(cè)不到C肽。經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，共培養(yǎng)組與單純培養(yǎng)組相比，細(xì)胞培養(yǎng)上清中胰島素分泌水平在不同

8、的培養(yǎng)時(shí)間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01)。共培養(yǎng)組：第3天和第14天的細(xì)胞培養(yǎng)上清中胰島素的分泌量無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)，但與第7天和第10天相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，第7天的細(xì)胞培養(yǎng)上清中胰島素的分泌水平最高，第10天的分泌量?jī)H次于第7天，但均明顯高于第3天和第14天；C肽的檢測(cè)結(jié)果與胰島素一致。共培養(yǎng)組胰島樣細(xì)胞的胰島素及C肽的分泌水平隨體外誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，均呈現(xiàn)先遞增后遞減的趨勢(shì)；
　　 6選取共培

9、養(yǎng)組和單純培養(yǎng)組培養(yǎng)至第7天的細(xì)胞進(jìn)行葡萄糖刺激胰島素釋放實(shí)驗(yàn)，共培養(yǎng)組的細(xì)胞在含葡萄糖1000mg/dl的無(wú)血清L-DMEM培養(yǎng)基中檢測(cè)到胰島素的分泌量為19.6025±5.9516μIU/ml，在含葡萄糖4500mg/dl的無(wú)血清H-DMEM中檢測(cè)到胰島素的分泌量為27.6617±7.14825μIU/ml，單純培養(yǎng)組的細(xì)胞在含葡萄糖1000mg/dl的無(wú)血清L-DMEM培養(yǎng)基中胰島素的分泌量為5.8000±1.006μIU/ml，

10、在含葡萄糖4500mg/dl的無(wú)血清H-DMEM中檢測(cè)到胰島素的分泌量為6.2100±1.1746μIU/ml。共培養(yǎng)組的胰島樣細(xì)胞，在高糖和低糖培養(yǎng)基中胰島素的分泌水平具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01)，胰島素的分泌量隨葡萄糖濃度的增加明顯增加，胰島樣細(xì)胞的葡萄糖刺激指數(shù)為1.4372±0.1390。單純培養(yǎng)組細(xì)胞的胰島素分泌對(duì)葡萄糖的刺激變化不大(p＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 人臍帶Wharton’s Je