廣西犬H9N2和類禽型H1N1豬流感病毒的遺傳進化分析及對小鼠致病性的研究.pdf

1、H9N2亞型和H1N1亞型流感病毒是流感大家庭里面兩個重要的病原，它們都在正粘病毒科A型流感病毒屬，基因組包括八個分節(jié)段的基因片段，共編碼約11種蛋白。H9N2亞型流感病毒于1966年首次在意大利分離到，H1N1亞型流感最先于1918年在美國報道，目前的研究表明兩種流感病毒都能夠突破種間障礙感染豬、雪貂等動物，但還沒有在犬身上分離到H9N2亞型流感病毒的報道，對廣西H1N1流感病毒致病性的研究也很少，因此開展對H9N2和H1N1亞型流感

2、病毒的流行病學(xué)調(diào)查、遺傳演化分析和致病性研究有重要意義。
　　本研究對采自廣西各地市的588份寵物犬棉拭子樣品和1038份發(fā)病豬肺組織樣品進行病毒分離。將采集到的樣品接種10日齡SPF雞胚后收取尿囊液，結(jié)果從犬棉拭子中共分離到13株H9N2亞型流感病毒，而從豬肺組織中共分離到14株類禽型H1N1亞型流感病毒，序列分析表明，13株H9N2亞型流感病毒與近年來廣西分離株A/equine/Guangxi/3/2011氨基酸同源性在99.

3、0％以上，內(nèi)部基因進化關(guān)系與2013年暴發(fā)的人H7N9很近，且8個基因片段來自于五個經(jīng)典的毒株，組成了一個新的基因型U;14株類禽型H1N1豬流感病毒中，2013年早期分離株的8個基因片段全部來自Avian-like亞系，隨后3、4月份分離株中7號和8號有一個基因片段來源于2009甲型流感，S2分離株中有兩個片段來自甲流，32號片段有三個片段來自甲流，而2013年5月底和2014年3月分離的六株病毒中6個片段來自甲流，病毒的基因中來源于

4、2009甲型流感的趨勢不斷增加。G2、G14、G21、G30、S2、32、7和8號毒株P(guān)B2氨基酸701位發(fā)生了天冬氨酸到天冬酰胺的突變，說明了毒株正逐漸適應(yīng)人源。
　　13株從犬棉拭子中分離到的病毒經(jīng)雞胚培養(yǎng)，測定每毫升病毒所含EID50為106.67～108.33;從發(fā)病豬組織分離到的H1N1豬流感病毒經(jīng)MDCK細(xì)胞培養(yǎng)，測定每毫升TCID50值為106.0～108.33。以106 EID50或TCID50的病毒液滴鼻攻毒BA

5、LB/c小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從健康寵物犬分離到的H9N2亞型的流感病毒不能感染小鼠，而從感冒犬分離到的病毒能夠在小鼠體內(nèi)復(fù)制，且能引起明顯的臨床癥狀，但不引起小鼠死亡;類禽型H1N1豬流感病毒均能夠在小鼠體內(nèi)復(fù)制，其中6號毒株毒力最強，感染小鼠后引起明顯的臨床癥狀，體重迅速下降，在一周內(nèi)全部死亡，而且在肺、鼻甲骨、脾、腎等組織器官內(nèi)均能檢測到病毒滴度，說明病毒已經(jīng)呈現(xiàn)全身感染;8號毒株毒力最弱，感染小鼠只引起輕微臨床癥狀，而后迅速恢復(fù)正常，且

6、只能在肺臟內(nèi)檢測到病毒滴度104.0±0.33 TCID50/mL。
　　為了研究H9N2毒株和H1N1毒株的致病性，還做了H9N2毒株和H1N1兩個亞型的毒株的傳代實驗，結(jié)果病毒在哺乳動物體內(nèi)連續(xù)傳代之后，其毒力會增強，而本研究中引起其毒力增強的氨基酸位點變化在H9N2中推測是PB2的611位和PA623位，H1N1傳代四次后與親本毒株比較有17個氨基酸位點改變，分析這些位點，引起H1N1氨基酸位點可能是PA基因的357位L→T

7、的突變。類禽型H1N1豬流感病毒7號和B2號毒株攻毒后第七天小鼠體重恢復(fù)，第十天能造成再次體重下降，說明能夠造成小鼠二次感染，其免疫原性差。
　　本研究對廣西犬中H9N2亞型和豬群中類禽型H1N1流感病毒的流行病學(xué)、遺傳演化及致病性等方面進行研究，結(jié)果表明在廣西的犬只中普遍有H9N2亞型流感病毒感染，H9N2亞型流感病毒宿主范圍的進一步擴大，廣西豬群中類禽型H1N1豬流感病毒也普遍存在，且氨基酸位點的改變能夠影響病毒的致病性。實驗