豬源2009甲型H1N1大流行流感病毒及其H9N2重組病毒在哺乳動物模型的致病性和傳播特性.pdf

1、PathogenicityandTransmissibilityofSwineOrigin2009PandemicHINlInfluenzaVirusesandTheirReassortantH9N2InfluenzaVirusesinMammalianModelsADissertationSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofPhilos

2、ophylnPreventiveVeterinaryMedicineCollegeofVeterinaryMedicineYangzhouUniversityYangzhou，PRChinaPhDcandidate：LiangHeAdvisor：ProfXiufanLiuMay2014II揚州大學博士學位論文CA04這對模式病毒成功建立了評價強弱毒力的2009甲型H1N1病毒的小鼠動物模型。流感病毒獲得結合a2，6唾液酸受體的能力是其在

3、哺乳動物間有效傳播的先決條件。為進一步研究5株2009甲型H1N1病毒在哺乳動物模型的傳播能力，我們首先對其進行了受體結合能力的測定。結果表明，人源2009甲型H1N1參考株CA04顯示出完全的a2，6唾液酸受體(人源受體)結合能力，而其余4株豬源的2009甲型H1N1病毒均獲得了不同程度的結合a2，3唾液酸受體(禽源受體)的能力。其中，A／Swine／Jiangsu／46／2010(JS46)和A／Swine／Jiangsu／48／2

4、010(JS48)兩株流感病毒顯著偏嗜于結合旺2，3唾液酸受體。與在豚鼠動物模型上的直接接觸傳播能力測定結果相對應，JS46和JS48分別表現出一過性的和無法檢測到的直接接觸傳播能力，而其余的病毒的直接接觸傳播效率為100％。因此，我們假設是JS46和JS48的受體結合能力的改變導致這種直接接觸傳播能力的下降。通過生物信息學的方法比較了JS48和CA04的HA蛋白序列和結構的差異，初步確定HA的N159D和Q226R雙突變的聯(lián)合作用改變

5、了病毒的受體結合能力。為證明N159D和Q226R聯(lián)合突變對直接接觸傳播能力的影響，通過反向遺傳技術拯救了CA04原毒rCA04，單突變病毒rCA04159和rCA04226，以及雙突變病毒rCA04159／226，并在此在豚鼠模型進行了直接接觸傳播能力的檢測。結果顯示，只有雙突變病毒rCA04159／226的直接接觸組豚鼠鼻洗液無法檢測到病毒，其余3株拯救毒均可以發(fā)生100％的傳播效率。進一步的統(tǒng)計表明，雙突變后的rCA04159／2

6、26在攻毒組豚鼠鼻腔的復制能力顯著降低。單突變Q226R可以通過減慢病毒傳播速率的方式影響直接接觸傳播。然而，盡管rCA04159／226雙突變病毒接觸組豚鼠無法檢測到排毒，血清抗體檢測卻顯示出60％的豚鼠發(fā)生了血清陽性轉換，表明N159D和Q226R雙突變具有聯(lián)合作用可以極顯著的降低直接接觸傳播能力，但并沒有使傳播完全消失。我們在對江蘇地區(qū)的豬流感流行病學監(jiān)測中還發(fā)現，當前流行于我國的h9425的H9N2禽流感病毒也感染豬群，這就為H

7、9N2禽流感病毒與2009甲型H1N1大流行流感病毒的重組提供了可能。為了預測這種重組的潛在大流行風險，我們通過反向遺傳技術，以CA04、JS48和A／Swine／Jiangsu／285／2010(JS285)三株不同宿主源的2009甲型H1N1的內部基因為骨架，將一株豬源的H9N2禽流感病毒A／Swine／Taizhou／5／08(TZ5)的HA單替換或將HA和NA雙替換其中分別拯救了H9N1pHlNl和H9N2pHlNl重組病毒。重