大豆疫霉RxLR效應(yīng)分子Avh241的功能研究.pdf

1、大豆疫霉（Phytophthora sojae）引起的大豆根莖腐病是威脅全世界大豆生產(chǎn)的毀滅性病害之一，每年導(dǎo)致全球十幾億美元的直接經(jīng)濟(jì)損失。研究大豆疫霉侵染大豆過程中效應(yīng)分子的作用機(jī)制對(duì)于進(jìn)一步揭示在與寄主互作過程中的病原菌的侵染機(jī)制非常重要。大豆疫霉基因組中有將近400個(gè)RxLR效應(yīng)分子，研究發(fā)現(xiàn)效應(yīng)分子的RxLR motif可以與植物細(xì)胞膜上的PI3P結(jié)合，幫助效應(yīng)分子進(jìn)入寄主細(xì)胞內(nèi)。目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些效應(yīng)分子能夠在植物細(xì)胞內(nèi)

2、發(fā)揮毒性功能，抑制植物的免疫反應(yīng)，幫助病原菌的侵染。
　　 本實(shí)驗(yàn)室之前對(duì)大豆疫霉RxLR效應(yīng)分子的功能進(jìn)行大規(guī)模的篩選，發(fā)現(xiàn)大多效應(yīng)分子都能夠抑制植物的細(xì)胞死亡，也有部分效應(yīng)分子可以直接誘導(dǎo)植物免疫反應(yīng)。在侵染初期顯著上調(diào)表達(dá)的效應(yīng)分子主要作用是抑制植物對(duì)病原菌識(shí)別產(chǎn)生的PTI(PAMP-triggered immunity)，組成型高表達(dá)的效應(yīng)分子則與抑制ETI(Effector-triggeredimmunity)有關(guān)，效

3、應(yīng)分子轉(zhuǎn)錄的精確編程對(duì)于大豆疫霉的致病性非常重要，效應(yīng)分子之間相互協(xié)作以“團(tuán)隊(duì)作戰(zhàn)”的方式干擾植物的抗病反應(yīng)，促進(jìn)病原菌的侵染。
　　 本研究綜合之前對(duì)于大豆疫霉效應(yīng)分子功能的大規(guī)模篩選結(jié)果，挑選出了15個(gè)RxLR效應(yīng)分子進(jìn)行進(jìn)一步分析。首先通過Solexa數(shù)據(jù)庫對(duì)這些效應(yīng)分子轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有幾個(gè)效應(yīng)分子通過Solexa檢測不到表達(dá)，其余的都在侵染初期有不同程度的上調(diào)表達(dá)，說明這些效應(yīng)分子在侵染初期對(duì)病原菌侵染和定殖可能

4、有重要的作用。在植物細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)這些效應(yīng)蛋白與GFP的融合蛋白，進(jìn)行亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，效應(yīng)分子Avh18、Avh94、Avh97、Avh172、Avh244、Avh247、Avh256和Avh260定位在植物細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)核中;效應(yīng)分子Avh23、Avh52和Avh240定位在植物的細(xì)胞核中;另外，效應(yīng)分子Avh181和Avh241定位在植物的細(xì)胞膜上。
　　 大豆疫霉的不同效應(yīng)分子在植物中的亞細(xì)胞定位具有多樣性，這種定位的

5、多樣性決定了效應(yīng)分子在植物細(xì)胞中作用的多樣性。其中，能夠在煙草上引起強(qiáng)烈壞死反應(yīng)的效應(yīng)分子Avh241在煙草細(xì)胞、洋蔥表皮細(xì)胞以及擬南芥原生質(zhì)體中都定位于細(xì)胞膜上。同時(shí)，通過在大豆、番茄、擬南芥上瞬時(shí)表達(dá)Avh241都能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。生物信息學(xué)分析比對(duì)發(fā)現(xiàn)Avh241蛋白與已知蛋白序列無明顯同源性。通過對(duì)十幾種不同大豆疫霉小種中的Avh241基因進(jìn)行克隆測序比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其在種內(nèi)很保守，沒有序列多態(tài)性。同時(shí)，我們對(duì)Avh241的不同突變體

6、進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)Avh241的59到168位氨基酸對(duì)于引起細(xì)胞死亡的功能是必須的。Avh241蛋白的N端6個(gè)氨基酸GAAKAK決定了蛋白的膜定位，且膜定位與引起細(xì)胞死亡的功能密切相關(guān)。
　　 Avh241能夠引起多種植物的細(xì)胞死亡，所以這種細(xì)胞死亡是廣譜性的。通過在不合抗病基因和含有不同抗病基因的大豆品種上瞬時(shí)表達(dá)Avh241，發(fā)現(xiàn)均能夠引起細(xì)胞死亡，說明這種細(xì)胞死亡是不依賴于目前已發(fā)現(xiàn)的大豆抗病基因的。Avh241能夠引發(fā)擬

7、南芥的突變體rpm1，sgt1b和rar1的原生質(zhì)體細(xì)胞死亡，說明被識(shí)別的途徑也不依賴于Rpm1，SGT1b和RAR1。在真核生物中，MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)信號(hào)途徑非常保守，是PTI和ETI信號(hào)傳導(dǎo)的主要途徑之一。利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默的方式將煙草中的APKKKα、MEK1、MEK2、WIPK、SIPK、NTF6、WRKY1和WRKY2等幾個(gè)與MAPK途徑相關(guān)的基因沉默后，在煙草上瞬時(shí)表達(dá)Avh241，發(fā)現(xiàn)MAPKKKα、MEK1、SIPK、

8、NTF6、WRKY1和WRKY2等六個(gè)基因沉默后不影響細(xì)胞死亡的產(chǎn)生，而MEK2和WIPK沉默后，細(xì)胞死亡明顯降低。以上結(jié)果說明，Avh241被植物識(shí)別引起的細(xì)胞死亡是不通過R基因及SGT1b和RAR介導(dǎo)的，而是依賴MAPK級(jí)聯(lián)途徑中的MEK2和WIPK信號(hào)途徑。
　　 Avh241在大豆疫霉侵染寄主的初期上調(diào)表達(dá)，這說明Avh241在侵染過程中應(yīng)該有比較重要的作用。為了確定在侵染寄主大豆時(shí)，Avh241對(duì)大豆疫霉毒性的貢獻(xiàn)，我

9、們利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)將大豆疫霉中的Avh241基因進(jìn)行沉默，得到了三個(gè)沉默轉(zhuǎn)化子。對(duì)致病性測定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化子致病力下降。這表明在侵染過程中，Avh241具有毒性功能。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Avh241的毒性功能，我們?cè)跓煵葜兴矔r(shí)表達(dá)Avh241（通過Avh172抑制其誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡活性），能夠促進(jìn)辣椒疫霉對(duì)煙草的侵染。通過檢測Avh241的突變體Avh241-4(80-188aa)，發(fā)現(xiàn)它也能夠促進(jìn)辣椒疫霉對(duì)煙草的侵染。Avh241