重組馬白細(xì)胞介素-18的鑒定及其定量抗原捕獲ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、白細(xì)胞介素-18(IL-18)是一種重要的細(xì)胞因子，它能作用于I型輔助性T細(xì)胞(Th1)，并在IL-12的協(xié)同作用下能強(qiáng)烈誘導(dǎo)其產(chǎn)生IFN-γ。近來研究表明：IL-18具有廣泛的生物學(xué)活性，在介導(dǎo)細(xì)胞免疫、抵抗微生物感染和抗腫瘤方面起著重要的作用。因此，IL-18在臨床上可作為免疫增強(qiáng)劑、抗微生物或抗腫瘤制劑得以應(yīng)用。到目前為止，國(guó)內(nèi)外已有人、小鼠、猴、豬、牛和羊等種屬的IL-18商品化制劑及其相應(yīng)的單克隆抗體(McAb)或多克隆抗體(

2、PcAb)以及夾心ELISA試劑盒的商品化供應(yīng)。然而，有關(guān)馬IL-18(EIL18)的研究較少且相對(duì)滯后，迄今為止，還未見有可供商品化的EIL-18和抗EIL-18McAb或PcAb及其夾心ELISA試劑盒等相關(guān)產(chǎn)品。 本研究采用RT-PCR從經(jīng)ConA刺激的馬外周血單核細(xì)胞(PBMCs)，中擴(kuò)增獲得編碼EIL-18前體蛋白(precursorEIL-18，pEIt-18)的DNA，然后克隆至載體PMD18-T中，鑒定正確的重組

3、質(zhì)粒命名為PMD-EIL-18。 自PMD-EIL-18中分別擴(kuò)增pEIL-18及其成熟蛋白(matureEIL-18，mEIL-18)基因，并將其亞克隆至原核表達(dá)載體pET-28a(+)和PET-26b(+)中，重組質(zhì)粒鑒定正確后命名為pET-pEIL-18、pET-EIL-18和pET-mEIL-18。 然后分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果表明所得到重組蛋

4、白分別約為25kD、20kD和18kD，經(jīng)Western-blot鑒定結(jié)果表明這3種重組蛋白均能與兔抗人IL-18發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)，將這3種表達(dá)的重組蛋白分別命名為rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18。 在此基礎(chǔ)上，本研究建立了rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18在非變性狀態(tài)下通過鎳柱親和層析或偶聯(lián)了抗EIL-18McAb的CNBr-activatedSepharose4B親和層析純化重組蛋白的方法，采

5、用該方法純化獲得了高純度的重組蛋白rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18。 為鑒定所獲得的重組蛋白rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18是否具有生物學(xué)活性，本研究還建立了一種檢測(cè)馬IFN-γmRNA拷貝數(shù)的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，并采用本方法評(píng)價(jià)了rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18在重組人白細(xì)胞介素-12(rhIL-12)協(xié)同下在體外刺激馬PBMCs所產(chǎn)生IFN-γ的狀況。結(jié)果表明，

6、rpEIL-18不具有相應(yīng)的生物學(xué)活性，而rEIL-18和rmEIL-18具有類似天然EIL-18生物學(xué)活性的特性： 利用上述純化后的rEIL-18抗原免疫新西蘭白兔，制各了高效價(jià)的抗EIL-18PCAb。 同時(shí)，采用相同抗原免疫BALB/c小鼠，取脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，以昆蟲/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得的重組mEIL-18(rAcEIL-18)作為檢測(cè)抗原進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，共篩選獲得9株能穩(wěn)定分泌抗體的

7、單細(xì)胞克隆株。利用Western-blot和IFA實(shí)驗(yàn)對(duì)9株單克隆抗體(McAbs)進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，所獲得的9株細(xì)胞分泌的抗體均能與rEIL-18和rAcEIL-18發(fā)生特異性反應(yīng)。將此9株McAbs分別與用原核系統(tǒng)分段表達(dá)的重組馬白細(xì)胞介素-18成熟蛋白mEIt-181-78和mEIL-1879-157進(jìn)行特異性ELISA檢測(cè)，結(jié)果表明，其中5株能識(shí)別所表達(dá)的mEIL-181-78，而另外4株能與mEIL-1879-157發(fā)生反應(yīng)

8、，說明所獲得的9株McAbs至少能針對(duì)rmEIL-182個(gè)或2個(gè)以上不同的抗原表位。采用單克隆抗體亞型鑒定試劑盒對(duì)該9株McAbs進(jìn)行亞型鑒定，結(jié)果表明，除M1F11、M3A11和N7D9為IGM，其余的McAbs均為IgG1，而且所有McAbs的輕鏈均為K鏈。將9株McAbs分別與rEIL-18和rmEIL-18進(jìn)行中和活性測(cè)定，結(jié)果表明SID7株對(duì)有生物活性的rEIL-18和rmEIL-18均具有中和效應(yīng)。 將抗EIL-18

9、的McAbs和PcAb進(jìn)行粗提和親和層析純化，并對(duì)純化后S6A3和B1G1株McAbs和PcAb進(jìn)行生物素標(biāo)記。通過對(duì)各株McAb或PcAb分別作為捕獲抗體或檢測(cè)抗體進(jìn)行初步的配對(duì)篩選后，以親和純化的S6A3株McAb作為捕獲抗體，生物素標(biāo)記的B1G1株McAb作為檢測(cè)抗體，經(jīng)方陣試驗(yàn)優(yōu)化抗原捕獲ELISA反應(yīng)體系，以不同濃度梯度的rEIL-18為捕獲抗原進(jìn)行ELISA檢測(cè)繪制其OD值-抗原濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定檢測(cè)靈敏度為15pg/mL采

10、用所建立的抗原捕獲ELISA檢測(cè)方法對(duì)健康和EIAV感染的馬血清及豬、牛、羊血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，豬血清、牛血清和羊血清在該檢測(cè)方法中均無發(fā)生交叉反應(yīng)性，健康馬血清中EIL-18的含量在40-80pg/mL之間，而EIAV感染后的馬血清中EIL-18含量略微升高，在70-150pg/mL之間。 由于各種屬的IL-18存在一定的交叉反應(yīng)性，為了檢測(cè)本研究所獲得抗EIL-18McAbs是否能夠用于檢測(cè)其他種屬IL-18并確定其檢測(cè)

11、極限，參照配對(duì)篩選結(jié)果和上述建立好的EIL-18定量抗原捕獲ELISA檢測(cè)方法，以S1C6株McAb作為捕獲抗體，生物素化的抗EIL-18PcAb為檢測(cè)抗體，商品化的重組豬IL-18(rPIL-18)為捕獲抗原繪制OD值-抗原濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定檢測(cè)靈敏度為30pg/mL，建立了基于抗EIL-18抗體為檢測(cè)和捕獲抗體的豬IL-18(PIL-18)定量抗原捕獲ELISA檢測(cè)方法；以S5F1株McAb作為捕獲抗體，生物素化的抗EIL-18Pc