牛γ干擾素抗原捕獲ELISA檢測方法的建立及初步應用.pdf

1、牛結核病是由牛結核分枝桿菌感染引起的一種重要人獸共患病。牛結核分枝桿菌可以感染奶牛、鹿、獾等20多種溫血動物，還可以通過呼吸道及消化道途徑感染人類。研究表明，10％的人類結核病例由牛結核分枝桿菌感染引起，所以牛結核病不僅給畜牧業(yè)造成重大經(jīng)濟損失還嚴重威脅人類健康。 由于目前尚無有效疫苗預防牛結核病，所以各國普遍采取“檢疫-撲殺”策略控制疾病傳播。結核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應實驗(Tuberculin skintest，TST)一直被用于

2、牛結核病的檢測，但其敏感性低、特異性差、難以檢測早期牛結核感染。IFN-γ作為Th1型細胞免疫效應的主要指征在牛結核分枝桿菌感染早期分泌水平顯著升高，這為開發(fā)早期牛結核病的有效檢測試劑指明了方向。1990年Wood建立抗原特異性牛IFN-γ夾心ELISA方法用于牛結核病檢測，已在多國應用，評價較好，有望替代傳統(tǒng)牛結核病檢測方法。但由于進口試劑盒價格昂貴，難以在我國推廣，所以應該著力開發(fā)我國自主知識產(chǎn)權的新型牛結核病檢測試劑盒。

3、本研究通過對本室研制的13株小鼠抗rHis-BoIFN-γ單克隆抗體(Monoclonal antibodies，McAb)進行鑒定，篩選出3株針對天然牛IFN-γ的單抗，經(jīng)初步配對建立牛IFN-γ夾心ELISA檢測方法，但效果不佳。后將單抗與制備的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清配對建立了牛IFN-γ抗原捕獲ELISA檢測方法，可有效檢測天然牛IFN-γ。初步臨床應用顯示建立的方法檢測臨床樣本奶牛天然IFN-γ與進口試劑盒符合率為

4、83.9％。這為進一步開發(fā)牛IFN-γ ELISA試劑盒以及牛IFN-γ ELISPOT檢測方法奠定了基礎，也為我國牛結核病防控提供了一種有效檢測試劑。 1.抗牛IFN-γ單克隆抗體的鑒定 采用Dot-ELISA方法對13株單抗分別與rHis-BoIL-4、rGST-BoIL-4、rHis-BoIFN-γ、rGST-BoIFN-γ、rHis-ChIFN-γ、rHis-ChIL-4、rGST-ChIL-4，以及BL21(D

5、E3)(pET)和BL21(pGEX-6P-1)經(jīng)IPTG誘導后的超聲波裂解液上清的反應性進行鑒定；通過Western-blot試驗鑒定單抗與重組菌BL21(DE3)(pET-BoIFN-γ)、BL21(DE3)(pET)全菌蛋白的反應性；通過間接ELISA實驗證明13株單抗與商品化rBoIFN-γ反應性，最終確定13株單抗均特異針對rBoIFN-γ而不與無關蛋白成分反應。對體內(nèi)誘生的腹水效價進行測定發(fā)現(xiàn)除單抗9G11，其余單抗腹水效價

6、都在1：80000以上。 2.牛IFN-γ抗原捕獲ELISA檢測方法的建立 采用辛酸-硫酸銨兩步法對體內(nèi)誘生的單抗腹水進行純化獲得了純度高、生物活性好的純化抗體。采用相加ELISA實驗對單抗針對的抗原表位進行鑒定，并對針對不同抗原表位的單抗6F8、1G5進行生物素化，同時用HRP標記單抗8D3。得到Biotinylated6F8效價為1:10000，HRP-8D3效價為1：3200。用本室保存的rHis-BoIFN-γ做

7、待檢抗原，單抗3E6/1C12與Biotinylated6F8直接配對建立了rBoIFN-γ雙抗體夾心ELISA檢測方法，靈敏度達0.5ng/mL，并能檢出1.6ng/mL商品化rBoIFN-γ，但檢測天然BoIFN-γ效果不佳。所以我們又建立了BoIFN-γ抗原捕獲ELISA檢測方法。 以rHis-BoIFN-γ做免疫原免疫兔子制備了兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清。用PWM刺激奶牛全血產(chǎn)生的天然BoIFN-γ篩選出與之反

8、應的三株單抗5E11、6F8、8D3。將單抗5E11按照40μg/mL濃度包被與1：3000倍稀釋的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清配對，以1：6000稀釋的商品化羊抗兔酶標抗體做指示抗體建立牛IFN-γ抗原捕獲ELISA檢測方法，可有效檢測天然BoIFN-γ。 3.牛IFN-γ抗原捕獲ELISA檢測方法的初步應用 用進口試劑盒Mycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kit

9、 for cattle對江蘇部分地區(qū)奶牛結核病做調(diào)查，期間檢測A地奶牛117頭，檢出禽結核陽性15例，可疑牛結核3例，未檢出陽性牛結核。檢測B地奶牛場奶牛59頭，檢出9例牛結核陽性，2例禽結核陽性，可疑牛結核10例。這在一定程度反應出兩地牛結核病控制措施的差異。將獲得的部分臨床檢測血清樣本用牛IFN-γ抗原捕獲ELISA方法檢測，兩種方法檢測牛IFN-γ的符合率達到83.9％。 結果表明建立的牛IFN-γ抗原捕獲ELISA檢測方