海洋拮抗菌及捕食細菌的篩選及兩株拮抗菌的初步研究.pdf

1、據(jù)報道，“超級細菌”每年導致全球約70萬人死亡，23萬新生嬰兒夭折，至2050年，死亡人數(shù)可能超過1000萬。耐藥病原菌的不斷增加及擴散成為了一個不容忽視的問題，但是新型抗生素的發(fā)現(xiàn)步伐日趨減慢，因此新型抗生素的挖掘顯得尤為重要。本論文通過威海金海灘、小石島和雙島灣近海三個地點的樣品富集，利用稀釋涂布的方法分離得到可培養(yǎng)海洋微生物，然后采用點種法篩選得到118株海洋拮抗菌和4株捕食細菌。
　　本論文從篩選出的海洋拮抗菌中挑選了兩株

2、編號分別為BXN2401和BXO402的拮抗菌株進行了初步研究，主要包括表型特征的分析，生理生化特征的鑒定，針對14株病原指示菌的抑菌譜的繪制，發(fā)酵條件的初步優(yōu)化，基因組信息分析及其拮抗基因的預測等。通過16S rDNA序列比對發(fā)現(xiàn)目前已有效發(fā)表的細菌物種中未定德研所菌(Desemzia incerta DSM20581T)與BXN2401擁有最高相似度(99.78％)，運動魯杰氏菌(Ruegeria mobilis DSM23403T

3、)與BXO402擁有最高相似度(99.35％)。通過抑菌譜的探索實驗發(fā)現(xiàn)菌株BXN2401對12株指示菌有較廣泛的抑菌效果，通過觀察其抑菌圈大小可以初步判斷菌株BXN2401對 Vibrio aestuarianus ATCC35048T， Vibriodiazotrophicus ATCC33466T, Vibrio gazogenes ATCC29988T, Vibrioparahaemolyticus ATCC17802T,Vib

4、rio natriegens ATCC14048T,Pseudomonasaeruginosa ATCC27853,Staphylococcus aureus ATCC25923, Staphylococcusaureus ATCC29213, Acinetobacter baumannii ATCC19606T和ArcobacterachromusNP18T都有較強的拮抗活性，菌株BXO402對Klebsiella pneumonia

5、eATCC700603、Escherichia coli ATCC25922和Staphylococcus aureus ATCC25923有較強的拮抗活性。然而通過兩株菌的發(fā)酵條件的優(yōu)化實驗，并未篩選出適合菌株BXO402的發(fā)酵培養(yǎng)基配方。通過對菌株BXN2401和BXO402基因組序列的生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，BXN2401有6個基因與產(chǎn)生抗生素相關(guān)的基因被比對、注釋出來，其中有兩個基因與產(chǎn)生青霉素和頭孢菌素相關(guān)，有3個基因與產(chǎn)生鏈霉素

6、相關(guān)，有一個基因與產(chǎn)生丁苷菌素和新霉素相關(guān);BXO402有17個基因與產(chǎn)生抗生素相關(guān)的基因被比對、注釋出來，其中有3個基因與產(chǎn)生青霉素和頭孢菌素相關(guān)，有9個基因與產(chǎn)生鏈霉素相關(guān)，有一個基因與產(chǎn)生丁苷菌素和新霉素相關(guān)，有4個基因與產(chǎn)生新生霉素相關(guān)。
　　本論文選取了12株常見病原菌標準菌株和兩株本實驗室正在鑒定的2株潛在病原菌作為被捕食細菌，初步探究了4株捕食細菌對這些菌株的捕食作用。實驗發(fā)現(xiàn)4株捕食細菌對本實驗中的14株指示菌有著

7、相似的捕食譜，并且四株捕食細菌對本實驗中的革蘭氏陰性和革蘭氏陽性指示菌都有捕食現(xiàn)象。
　　為了豐富海洋微生物資源的數(shù)據(jù)，本論文對本實驗室從不同的樣品中篩選出來的三株潛在海洋新物種進行了多相分類鑒定。
　　菌株FA150T分離自中國威海雙島灣近海，革蘭氏陰性菌，兼性厭氧。氧化酶和硝酸鹽還原實驗陽性，過氧化氫酶實驗陰性。菌株FA150T的主要脂肪酸為Summed Feature3(C16:1ω7c and/or iso-C15:

8、02-OH)(42.56％),C18:1ω7c(12.51％)，C16:0(10.43％)，C12:0(9.75％)和C14:0(9.11％)，主要呼吸醌為MK-6，主要極性脂為磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)和磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol，PG)，基因組DNA G+C含量為31.34 mol％。通過多相分類鑒定發(fā)現(xiàn)菌株FA150T為弓形菌屬（Arcobacter）的一個新物

9、種，命名為乳色弓形菌（Arcobacter lacteus sp.nov），模式菌株為FA150T(=KCTC42593T=MCCC1H00108T)。
　　菌株NP18T分離自榮成某海參養(yǎng)殖池，革蘭氏陰性菌，兼性厭氧。氧化酶、過氧化氫酶和硝酸鹽還原實驗陽性。菌株NP18T的主要脂肪酸為SummedFeature3(C16:1ω7c and/or iso-C15:02-OH)(44.01％),C16:0(19.59％),C14:0

10、(11.47％)，C18:1ω7c(9.85％)和C12:0(8.57％)，主要呼吸醌為MK-6，主要極性脂為磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol，PG)和雙磷脂酰甘油（Diphosphatidylglycerol，DPG），基因組DNA G+C含量為29.54 mol％。通過多相分類鑒定發(fā)現(xiàn)菌株NP18T為弓形菌屬(Arcobacter)的一個新物

11、種，命名為透明弓形菌(Arcobacter achromussp.nov.)，模式菌株為NP18T(=KCTC42592T=MCCC1H00109T)。
　　菌株SS2-24T分離自中國威海某海參養(yǎng)殖池，革蘭氏陰性菌，兼性厭氧。氧化酶實驗陽性，過氧化氫酶和硝酸鹽還原實驗陰性。菌株SS2-24T的主要脂肪酸為Summed Feature3(iso-C15:02-OH and/or C16:1ω7c)(25.49％),C16:0 Na

12、lcohol(13.50％), C16:0(12.46％),C17:010-methyl(11.07％), C18:1ω7c(6.34％)和C17:1ω8c(5.93％)，主要呼吸醌為Q-8，主要極性脂為磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）和磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol，PG)，基因組DNA G+C含量為51.09 mol％。通過多相分類鑒定發(fā)現(xiàn)菌株SS2-24T為湖菌屬（Lac