南蛇藤乙酸乙酯提取物對肝癌抑制作用的體內(nèi)及體外實驗研究.pdf

1、南蛇藤(CelastrusorbiculatusThunb.)為衛(wèi)矛科南蛇藤（celastrus）屬植物，分布廣泛，其藤莖、根、葉、果均可入藥?，F(xiàn)代藥物化學(xué)研究證實，其具有抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、抗生育等廣泛的藥理活性。目前，國內(nèi)外對南蛇藤抗癌活性及機(jī)理研究均有一定的報道。但對南蛇藤在抑制腫瘤生長及其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及途徑等方面的研究并不深入，特別是在肝癌的研究方面。本課題以南蛇藤乙酸乙酯提取物為研究對象，分別應(yīng)用體外細(xì)胞模型和

2、體內(nèi)動物模型對其抗肝癌的作用及機(jī)制進(jìn)行了研究，從分子、細(xì)胞、蛋白、整個機(jī)體等不同層面和角度揭示南蛇藤的抑制肝癌的作用，為尋找篩選中藥抗腫瘤藥物、充分開發(fā)利用祖國中醫(yī)藥資源提供依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　 [目的]：
　　 通過對南蛇藤乙酸乙酯提取物在體外對肝癌細(xì)胞的增殖的影響、對腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)以及在動物模型中抗肝癌作用的觀察，從分子水平、細(xì)胞水平和整體水平等不同角度研究南蛇藤對肝癌的生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用，初步探討其抗肝癌作

3、用的機(jī)理，為研究開發(fā)南蛇藤抗腫瘤資源打下基礎(chǔ)。
　　 [方法]：
　　 第一部分，南蛇藤對肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞毒性作用及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的實驗研究
　　 1．采用cck-8法檢測不同濃度南蛇藤乙酸乙酯提取物對培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞HepG2增殖的影響。
　　 2．通過雙苯酰亞胺33342(Hoechst33342)/PI染色后，在熒光顯微鏡下觀察經(jīng)南蛇藤乙酸乙酯提取物誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡后細(xì)胞及細(xì)胞核的形

4、態(tài)變化。
　　 3．采用AnnexinV-FITC與碘化丙啶(promideiodine，PI)雙染色法，通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測南蛇藤乙酸乙酯提取物干預(yù)HepG2細(xì)胞24小時后的人肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡數(shù)量、細(xì)胞周期的影響。
　　 4．采用瓊脂糖凝膠電泳分析南蛇藤乙酸乙酯提取物作用于HepG2細(xì)胞后凋亡細(xì)胞DNA降解程度。
　　 5．采用比色法試劑盒來檢測南蛇藤乙酸乙酯提取物誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡后對細(xì)胞內(nèi)cas

5、pase3的活性。利用BSA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，計算單位濃度蛋白所具有的caspase3的活性。
　　 6．通過流式細(xì)胞術(shù)檢測南蛇藤乙酸乙酯提取物干預(yù)HepG2細(xì)胞后活性氧化物的含量。
　　 7．應(yīng)用免疫印跡法檢測南蛇藤乙酸乙酯提取物干預(yù)HepG2細(xì)胞后相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)量。
　　 第二部分，南蛇藤對肝癌原位熒光動物模型腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用的研究
　　 1．建立原位熒光蛋白表達(dá)的裸鼠肝癌移植瘤

6、模型，采用活體熒光影像系統(tǒng)實時監(jiān)測南蛇藤不同劑量組對動物在體腫瘤生長速度的影響，繪制腫瘤生長曲線，并監(jiān)測治療結(jié)束時移植瘤的重量。
　　 2．采用活體熒光影像系統(tǒng)實時監(jiān)測南蛇藤不同劑量組對移植瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的影響，并分析評價南蛇藤提取物的藥物毒性和安全性。
　　 3．免疫組化法檢測南蛇藤不同治療劑量組腫瘤組織中VEGF的表達(dá)情況。
　　 4．用RT-PCR法檢測各實驗組腫瘤組織提取的總RNA中VEGFmRNA的水平。<

7、br>　　 5.TENEL法檢測各實驗組腫瘤組織細(xì)胞凋亡比率。
　　 6．免疫組化法檢測各實驗組腫瘤組織中caspase3的表達(dá)情況。
　　 7．用RT-PCR法檢測各實驗組腫瘤組織提取的總RNA中caspase3mRNA的表達(dá)水平。
　　 [結(jié)果]：
　　 第一部分：
　　 1．不同濃度的南蛇藤乙酸乙酯提取物（30、60、120、240、300μg/ml）對HepG2細(xì)胞均有一定的抑制作用，且

8、隨著藥物濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)，即對腫瘤細(xì)胞的抑制作用呈藥物劑量依賴性。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，各組差異有顯著意義(P＜0.05)。
　　 2．隨著藥物濃度的增加，HepG2細(xì)胞生長被抑制，細(xì)胞凋亡的數(shù)量增多。同時，隨著作用時間的延長，細(xì)胞凋亡的數(shù)量增多，有時間依存性，而對照組細(xì)胞生長良好。
　　 3.AnnexinV-PI檢測數(shù)據(jù)也表明隨著南蛇藤提取物濃度(15-120μg/ml)的提高，早期細(xì)胞凋亡的數(shù)量增加，在一定程度

9、上存在量效關(guān)系。
　　 4．藥物干預(yù)24h后，HepG2細(xì)胞生長的細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，以240μg/ml劑量組最為顯著(P=0.01)：同時HepG2細(xì)胞生長過程中出現(xiàn)了亞二倍峰，說明細(xì)胞發(fā)生了凋亡。
　　 5．隨著南蛇藤提取物劑量的提高和作用時間的延長，DNA降解梯帶表現(xiàn)越明顯，亦表明藥物引起的細(xì)胞凋亡與藥物干預(yù)的劑量和作用時間存在依存性。
　　 6.Caspase3活性檢測表明，無論在24h干預(yù)組或4

10、8h干預(yù)組，隨著南蛇藤提取物濃度（30、60、120μg/ml）增加，Caspase3活性逐漸增強(qiáng)，與劑量呈依存性。在南蛇藤120μg/ml組，caspase3的活性在藥物作用24h時表現(xiàn)最強(qiáng)。
　　 7．南蛇藤乙酸乙酯提取物作用HepG2細(xì)胞24小時后，細(xì)胞產(chǎn)生的ROS的量與藥物的濃度呈一定的依存性，且具有統(tǒng)計學(xué)上的意義(P＜0.01）。另外，60μg/ml南蛇藤提取物作用細(xì)胞24h時，ROS的表達(dá)量呈現(xiàn)高峰濃度。
　　

11、 8．南蛇藤乙酸乙酯提取物干預(yù)HepG2細(xì)胞后，與陰性對照組比較，Cytochrome-c、pro-caspase9和caspase3的蛋白表達(dá)量增加；同時，隨南蛇藤提取物濃度（30、60、120μg/ml）的增加，蛋白的表達(dá)亦增強(qiáng)。與陰性對照組比較，藥物干預(yù)組Endo-nucleaseG的表達(dá)量也增加。
　　 第二部分：
　　 1．自RFP-Herp-G-2細(xì)胞接種第20天治療組開始用藥，第31天影像掃描提示各組移植

12、瘤體積出現(xiàn)差異。至第45天，G1、G2、G3、G4、G5組移植瘤的體積分別為803.1mm3、83.8mm3、852.7mm3、410mm3、120.5mm3，G2、G3、G4、G5組移植瘤的體積分別為空白對照組的10.1％、106.2%、51.1%、15.0%；實驗終止（第45天）時，G1、G2、G3、G4、G5組移植瘤重量分別為0.95g.0.36克、0.67g.0.48g、0.38g，G2、G3、G4、G5組移植瘤的重量分別為空白

13、對照組的37.9%、70.5%、50.5%、40.0%。
　　 2．大劑量南蛇藤治療組、小劑量南蛇藤治療組、南蛇藤預(yù)防治療組與空白對照組在實驗開始45天后，各組之間的腫瘤轉(zhuǎn)移率沒有明顯的差異。奧沙利鉑治療組在治療觀察過程中未發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移。在開始治療后，除奧沙利鉑治療組小鼠體重有所下降外，各組實驗鼠體重均無明顯下降。
　　 3．免疫組化結(jié)果顯示，VEGF主要在肝癌細(xì)胞的胞漿內(nèi)表達(dá)，部分肝癌細(xì)胞膜也有少量表達(dá)，偶見細(xì)胞間質(zhì)中

14、表達(dá)。奧沙利鉑治療組的陽性表達(dá)率最低，大劑量南蛇藤治療組、南蛇藤預(yù)防治療組的陽性表達(dá)率顯著低于小劑量南蛇藤治療組與空白對照組(P＜0.05)。
　　 4．各實驗組腫瘤組織中的VEGFmRNA水平與免疫組化結(jié)果中VEGF的表達(dá)水平呈平行關(guān)系。奧沙利鉑治療組的VEGFmRNA水平最低，大劑量南蛇藤治療組、南蛇藤預(yù)防治療組的VEGFmRNA水平顯著低于小劑量南蛇藤治療組與空白對照組(P＜0.01)。
　　 5．各實驗組腫瘤組織

15、的細(xì)胞凋亡的計數(shù)和凋亡率與各組腫瘤抑制程度相關(guān)，奧沙利鉑治療組、南蛇藤預(yù)防治療組細(xì)胞計數(shù)和凋亡率較高，但二組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 6．免疫組化研究結(jié)果表明，caspase3主要表達(dá)于肝癌細(xì)胞的胞漿內(nèi)，奧沙利鉑治療組的陽性表達(dá)率最高，大劑量南蛇藤治療組、南蛇藤預(yù)防治療組的陽性表達(dá)率顯著高于小劑量南蛇藤治療組與空白對照組(P＜0．05)。
　　 7．肝移植瘤組織中caspase3mRNA水平與免