控制性葉酸剝奪法誘導小鼠iPS細胞的研究.pdf

1、第一部分MEF細胞葉酸剝奪培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)的研究
　　目的：研究在葉酸剝奪條件下,小鼠胚胎成纖維(mouseembryonicfibroblast,MEF)細胞體外培養(yǎng)時重編程相關(guān)的多能性基因表達情況,了解葉酸是否參與細胞重編程過程。
　　方法：分別用葉酸剝奪培養(yǎng)基和含正常濃度葉酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)MEF細胞,分別在第3,6,9天比較兩者在多能性基因的甲基化狀態(tài)和多能性基因表達方面的變化。
　　結(jié)果：葉酸剝奪培養(yǎng)條件下,ME

2、F細胞的多能性基因(Oct4和Nanog)啟動子區(qū)發(fā)生去甲基化,相應的多能性基因表達增加。
　　結(jié)論：葉酸缺乏可促進細胞多能性基因Oct4和Nanog的表達,葉酸參與細胞的重編程過程,葉酸缺乏有利于細胞重編程的進行。
　　第二部分 葉酸剝奪條件下四因子重編程MEF細胞為iPS細胞的研究
　　目的：研究葉酸剝奪條件下利用4因子誘導小鼠多潛能干(inducedpluripotentstem,iPS)細胞的誘導效率,優(yōu)化iP

3、S細胞誘導體系。
　　方法：1)根據(jù)第一部分的結(jié)果,葉酸剝奪條件下培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維(mouseembryonicfibroblast,MEF)細胞3天作為實驗組;同時用含葉酸培養(yǎng)基培養(yǎng)MEF細胞3天作為對照組。2)然后利用經(jīng)典4因子對兩組細胞進行重編程,并對所得的誘導iPS細胞進行鑒定,兩組誘導效率進行比較;及對實驗組獲得的iPS細胞進行核型分析。
　　結(jié)果：葉酸剝奪條件下培養(yǎng)的MEF細胞,經(jīng)典4因子誘導體系的誘導效率較對

4、照組提高5倍(0.05％vs0.01%),獲得的iPS細胞保持未分化狀態(tài),多能性標記物檢測均為陽性,核型分析結(jié)果示正常細胞核型。
　　結(jié)論：本實驗證明了葉酸剝奪法可在不增加致癌性的前提下提高小鼠iPS細胞的誘導效率,為將來的iPS細胞的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　第三部分 葉酸剝奪條件下三因子誘導小鼠iPS細胞的研究
　　目的：葉酸剝奪條件下,利用三因子進行小鼠iPS細胞的誘導,減少致癌因子,優(yōu)化iPS細胞的誘導體系。

5、>　　方法：1)葉酸剝奪條件下培養(yǎng)3天的小鼠胚胎成纖維(mouseembryonicfibroblast,MEF)細胞作為實驗組;同時以含葉酸培養(yǎng)基培養(yǎng)3天的MEF細胞作為對照組;2)以兩組細胞為靶細胞,利用Oct4,Klf4和Sox2三種因子進行iPS細胞誘導,并對誘導獲得的iPS細胞進行鑒定。
　　結(jié)果：葉酸剝奪培養(yǎng)后的MEF細胞經(jīng)誘導可獲得iPS細胞,誘導效率約為0.01%,并對其鑒定結(jié)果示其AP,Oct4,SSEA-1染色