誘導小鼠ES-iPS細胞向角膜內皮細胞定向分化的研究.pdf

1、目的：
　　通過在體外分階段的序貫誘導途徑，探索小鼠胚胎干細胞(ES)及誘導型多潛能干細胞(iPS)向角膜內皮樣細胞定向分化的潛能，探究化學分子RA，細胞因子(bFGF、BMP4)聯(lián)合體細胞共培養(yǎng)誘導的具體條件和方案，以期闡明其定向分化中的關鍵機制，并驗證ES和iPS細胞作為角膜組織工程種子細胞的可行性，為組織工程角膜內皮層重建尋找來源充足，安全可靠的新型種子細胞奠定基礎。
　　方法：
　　1.體外撕膜法分離消化新西蘭

2、大白兔的角膜內皮細胞及晶狀體上皮細胞，建立培養(yǎng)擴增體系，并對其活力和特異性表達的標志物進行免疫熒光細胞化學（ICC）鑒定。收集晶狀體上皮細胞的條件培養(yǎng)液，采用MTT法、Ki67的免疫熒光檢測角膜內皮細胞在條件培養(yǎng)液中的增殖能力，用Western blot評估其表型標記物表達的變化。
　　2.應用mef制備feeder，聯(lián)合ES培養(yǎng)液維持和擴增小鼠ES細胞及iPS細胞系，并鑒定其全能性指標。去除lif因子及feeder，在低黏附培養(yǎng)

3、皿中懸浮培養(yǎng)擬胚體EB，EB形成第四天加入不同濃度RA,并在不同時間點用定量PCR檢測神經脊分化的指標。選擇和比較不同的細胞外基質包括纖維連接蛋白、層粘蛋白、明膠、多聚賴氨酸和組織液房水作培養(yǎng)板的包被對神經脊（neural crest,NC）細胞遷出分化的影響，并采用ICC法對分化標志物進行檢測。
　　3.用P2-P3的兔角膜內皮細胞和兔晶狀體上皮細胞分別進行如下共培養(yǎng)處理，包括：①條件培養(yǎng)液收集；②微膠囊包裹隔離共培養(yǎng)；③作為t

4、ranswell小室隔離共培養(yǎng)的細胞；④絲裂霉素C處理制備飼細胞鋪層；⑤活性細胞鋪層。將初步誘導的NC樣細胞序貫進入共培養(yǎng)階段，比較并確定合適的共培養(yǎng)方法。應用ICC對分化后內皮樣細胞進行表面標記關鍵分子的鑒定，定量PCR對分化后細胞mRNA表達譜的分析。
　　4.采用bFGF+BMP4單層貼壁法誘導ES細胞向神經脊干細胞分化，后續(xù)條件培養(yǎng)液誘導向角膜內皮樣細胞分化，并用ICC鑒定分化標記物的表達情況，用定量PCR分析基因表達的變

5、化。
　　結果：
　　1.兔角膜內皮細胞、晶狀體上皮細胞在體外可以穩(wěn)定地培養(yǎng)增殖，并表達其組織特異性的標記物。晶狀體的條件培養(yǎng)液對角膜內皮細胞的增殖沒有明顯影響，但能上調角膜內皮細胞中ZO-1，N-cadherin和Vimentin的表達。
　　2.ES/iPS細胞在lif和feeder的培養(yǎng)條件下表達全能性的標記物Oct4，SSEA-1，AP(+)；去除lif和feeder后，在懸浮培養(yǎng)過程中形成擬胚體EB，第四天添

6、加RA繼續(xù)培養(yǎng)，隨后的第四天獲得一組神經脊分化標記物最高的表達。EB重新貼壁后繼續(xù)培養(yǎng)時有大量細胞遷出，ICC檢測顯示有Nestin，P75，AP-2α，SOX10等的表達。
　　3.Transwell小室，微膠囊包裹的實驗組，EB細胞遷出生長，但不能維持良好的長勢；在活性細胞做鋪層的接觸共培養(yǎng)組，EB細胞遷出受阻，出現大量的細胞凋亡；在晶狀體上皮細胞及角膜內皮細胞條件培養(yǎng)液誘導7-8天后，誘導細胞形成緊密的鋪路石結構，表達AQP

7、1，ZO-1，Na+-K+-ATPase，N-cadherin等內皮標記。在長時間明膠鋪層及Fn、Ln、多聚賴氨酸和兔房水鋪層中，長時間明膠鋪層能較好地維持EB貼壁生長并促進向內皮樣細胞的分化。
　　4.在單層細胞貼壁分化中，bFGF+BMP4誘導ES-cells表達神經脊細胞的標記物，繼續(xù)晶狀體條件培養(yǎng)液誘導6d出現角膜內皮樣細胞標記物的表達。
　　結論：
　　1通過撕膜法可以建立穩(wěn)定的兔角膜內皮細胞和晶狀體上皮細胞

8、的培養(yǎng)體系。晶狀體上皮細胞條件培養(yǎng)液能更好地維持角膜內皮細胞的表型包括中ZO-1、N-cadherin、Vimentin，對細胞增殖沒有明顯影響。
　　2.小鼠ES/iPS細胞可以通過EB途徑經RA誘導向神經脊多潛能間充質干細胞分化。在定向分化中，長時間的明膠鋪層效果更優(yōu)于Laminin和Fibronectin所做的鋪層。
　　3.條件培養(yǎng)液是一種簡單、可行、可控的共培養(yǎng)模式。在序貫法誘導方案中，角膜內皮細胞條件培養(yǎng)液和晶狀