體外擴(kuò)增的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)輸對(duì)缺血性腦卒中的保護(hù)作用及抗炎機(jī)制.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　1.建立大鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells， Tregs)的分離和體外擴(kuò)增方法，并檢測(cè)分離的和擴(kuò)增的Tregs純度、活性及其免疫抑制活性。
　　2.探討體外擴(kuò)增的Tregs靜脈輸注移植對(duì)大鼠缺血性腦卒中的保護(hù)作用。
　　3.研究體外擴(kuò)增的Tregs輸注移植后腦缺血再灌注大鼠固有的和入侵的炎癥細(xì)胞的變化，并探討Tregs對(duì)腦缺血后神經(jīng)炎癥反應(yīng)的抑制作用。
　　研

2、究方法:
　　1.采用免疫磁珠細(xì)胞分選(Magnetic cell sorting，MACS)兩步法從健康成年SD大鼠脾臟和淋巴結(jié)中提取CD4+CD25+Tregs，然后加入刺激因子anti-CD3、anti-CD28、IL-2以及雷帕霉素與之共培養(yǎng)進(jìn)行體外擴(kuò)增。用流式細(xì)胞儀測(cè)定分離的以及培養(yǎng)的細(xì)胞中Tregs的純度，臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞的活性，體外增殖抑制試驗(yàn)測(cè)定新鮮分離的和擴(kuò)增的Tregs的增殖及其抑制功能。
　　2.線

3、栓法制備右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型，缺血2h再灌注。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、PBS處理組、脾細(xì)胞(SP)處理組和Treg細(xì)胞治療組。在Treg細(xì)胞輸注后3d、7d、14d采用Zea Longa、觸須誘導(dǎo)的前肢放置試驗(yàn)、足失誤試驗(yàn)、圓筒實(shí)驗(yàn)對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分;于術(shù)后2w采用水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)各組大鼠的空間認(rèn)知能力;行TTC染色和甲酚紫染色測(cè)量腦梗死體積比以及采用干濕稱(chēng)重法測(cè)量腦組織含水量;免疫熒光染色法檢測(cè)缺血腦組織Casp

4、ase-3的表達(dá)情況;Fluro-JadeB染色觀察神經(jīng)元退化情況。
　　3.模型處理和分組同前。于Treg細(xì)胞輸注后3d、14d采用免疫熒光和免疫組化染色觀察MPO、Ibal、GFAP在腦組織的表達(dá)情況以檢測(cè)Treg細(xì)胞輸注后對(duì)中性粒細(xì)胞(MPO)向腦部的浸潤(rùn)以及腦固有細(xì)胞如小膠質(zhì)細(xì)胞(Ibal)和星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)的反應(yīng)性的影響，并采用Werstern Blot方法進(jìn)一步驗(yàn)證各組大鼠腦組織中Ibal、GFAP的表達(dá)情況。

5、
　　結(jié)果:
　　1.MACS分選獲得的CD4+CD25+ regulatory T細(xì)胞的純度是84.50±5.08％，細(xì)胞存活率為95.22±2.97％。經(jīng)過(guò)3周體外培養(yǎng)擴(kuò)增，Tregs的純度為76.03+4.04％，細(xì)胞存活率為94.31±3.14％。體外增殖抑制實(shí)驗(yàn)表明Tregs能顯著抑制CD4+CD25-T細(xì)胞的增殖(P＜0.01)，體外擴(kuò)增的Tregs的抑制功能超過(guò)新鮮分離的細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

6、。
　　2.腦缺血再灌注后3d，模型組大鼠各項(xiàng)神經(jīng)功能評(píng)分達(dá)到高峰，與PBS組和SP組相比Tregs治療組的感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能得到顯著改善。Morris Water Maze test顯示在MCAO后14d，Tregs治療組的空間學(xué)習(xí)和記憶能力較PBS組和SP組均有顯著改善。TTC染色和甲酚紫染色結(jié)果顯示在MCAO后不同時(shí)間點(diǎn)Treg治療組的腦梗死體積較PBS和SP處理組均顯著降低。在MCAO后不同時(shí)間點(diǎn)，Tregs治療組的腦組織含水量

7、較PBS和SP處理組均有明顯改善;Caspase-3、Fluro-JadeB染色結(jié)果顯示Tregs治療組腦缺血半暗帶區(qū)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較PBS和SP處理組顯著降低。
　　3.免疫熒光染色觀察腦組織中中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，結(jié)果顯示假手術(shù)組無(wú)或可見(jiàn)少量散在分布的MPO+細(xì)胞，PBS組和SP組MPO+細(xì)胞在缺血再灌注1-3d時(shí)向腦部浸潤(rùn)明顯，Tregs治療組的MPO+細(xì)胞數(shù)顯著降低。免疫組化和免疫熒光染色結(jié)果顯示在腦缺血2w時(shí)Tregs治

8、療組Ibal陽(yáng)性和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較PBS和SP處理組顯著降低，WesternBlot結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。
　　結(jié)論：
　　1.本實(shí)驗(yàn)建立的分離和擴(kuò)增大鼠CD4+ CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的方法，可有效的獲得高純度、有活力且不影響其抑制功能的Treg細(xì)胞。
　　2.擴(kuò)增的CD4+CD25+Tregs治療性輸注可顯著降低大腦中動(dòng)脈阻塞腦缺血再灌注后腦梗死體積，降低凋亡及退化的神經(jīng)元數(shù)目，并顯著改善腦缺血再灌注后的神經(jīng)