神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)缺血性卒中的保護(hù)機(jī)制研究.pdf

1、腦卒中主要發(fā)生在老年人群中，是老年人群致殘的重要原因之一，以腦梗死為主。隨著我國(guó)人口進(jìn)入老齡化時(shí)代，腦梗死患病率逐年升高，嚴(yán)重降低了患者的生存質(zhì)量和平均壽命，嚴(yán)重危害老年人的身體健康，給國(guó)民經(jīng)濟(jì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。目前臨床上傳統(tǒng)抗凝、溶栓、神經(jīng)保護(hù)以及后期的康復(fù)等治療效果有限，大部分腦卒中患者后期仍留下各種偏癱、失語(yǔ)等不同程度的經(jīng)功能障礙后遺癥。因此，尋找新的治療方法促進(jìn)缺血性腦血管病患者神經(jīng)功能的恢復(fù)已成為當(dāng)今研究的重點(diǎn)[1]，在過(guò)去的四

2、十年里，腦卒中發(fā)病率在發(fā)達(dá)國(guó)家降低了43％，而在發(fā)展中國(guó)家卻增長(zhǎng)了100％，發(fā)生于這些國(guó)家的腦卒中死亡數(shù)約占腦卒中死亡總數(shù)的87％[2]。若沒(méi)有有效干預(yù)措施，至2030年全球腦卒中死亡人數(shù)將增加至780萬(wàn)[3]。
　　腦卒中患者中87％是缺血性腦梗死[4]。多種疾病均可能導(dǎo)致缺血性卒中，而其最重要的病因包括大動(dòng)脈粥樣硬化（血管），心源性腦栓塞，腦小血管?。ㄎ⒀懿∽儯２惶Ｒ?jiàn)的病因是頸部動(dòng)脈夾層動(dòng)脈瘤、腦血管炎、凝血功能障礙性疾

3、病、血液病等。即使在完成相關(guān)診斷檢查仍有部分缺血性腦卒中患者無(wú)法明確病因。對(duì)于急性缺血性腦梗死，F(xiàn)DA只認(rèn)證了早期溶栓作為治療手段。但由于時(shí)間窗的限制，95％以上的患者無(wú)法得到溶栓治療[5]。因此，探索新的、能讓更多患者受益的缺血性卒中治療策略具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　近年來(lái)，神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells，NSCs)在腦梗死治療中的應(yīng)用研究，為解決這一難題提供了新的思路和方法。國(guó)內(nèi)外已有相關(guān)研究證實(shí)了NSCS

4、s具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[6，7]。
　　1.在急性腦梗死的研究中，NSCs對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用尚不明確。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMECs)不僅僅是血管腔的內(nèi)襯，還能分泌活性物質(zhì)影響神經(jīng)元的生存。我們針對(duì)NSCs能否有效修復(fù)缺血損傷的BMECs開(kāi)展了進(jìn)一步研究。
　　2.我們發(fā)現(xiàn)NSCs可以通過(guò)直接或間接接觸的方式保護(hù)缺血損傷的內(nèi)皮細(xì)胞:在前期實(shí)驗(yàn)中，我們成功分離和培養(yǎng)了NSCs和BMECs;為了進(jìn)一步模擬缺血損傷中內(nèi)皮細(xì)

5、胞所處的病理生理?xiàng)l件，我們對(duì)BMEC實(shí)施了缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧(oxygen-glucose deprivation，OGD)的類(lèi)缺血再灌注損傷處理，并建立了這兩種細(xì)胞的共培養(yǎng)模型;證實(shí)了NSCs能有效保護(hù)和修復(fù)OGD-BMECs。那么，NSCs是通過(guò)什么機(jī)制來(lái)發(fā)揮這種保護(hù)作用的呢？早期的研究認(rèn)為干細(xì)胞分化和細(xì)胞融合是修復(fù)的可能機(jī)制，但是當(dāng)前更多的研究對(duì)以上兩種觀點(diǎn)提出了置疑。研究發(fā)現(xiàn)，用NSCs處理中動(dòng)脈栓塞(middle cerebr

6、al artery occlusion，MCAO)鼠模型，其功能評(píng)分得到很大改善，但GFP標(biāo)記顯示能夠真正到達(dá)病灶分化成神經(jīng)元的NSCs數(shù)量非常有限[8]。這些外源性NSCSs來(lái)源的神經(jīng)元細(xì)胞無(wú)法解釋小鼠功能評(píng)分的顯著改善。因此，促使人們探尋NSCSs的其它可能保護(hù)機(jī)制。
　　3.PI3K/Akt/GSK-3b/mTOR信號(hào)通路參與了代謝調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長(zhǎng)和存活等多種重要功能。
　　PI3K活性形式為一種原癌基因，多種腫瘤疾病發(fā)

7、現(xiàn)有PI3K的異常擴(kuò)增和突變。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，基于結(jié)構(gòu)、分布及活化機(jī)制的不同，PI3K可被分為三類(lèi)，Ⅰ類(lèi)PI3Ks分為Ⅰa和Ⅰb兩類(lèi)[9]。ⅠA類(lèi)PI3K可被受體酪氨酸激酶激活，而Ⅰb類(lèi)PI3K則被G蛋白偶聯(lián)受體激活。這些PI3K均是由調(diào)節(jié)亞基（如p85）和催化亞基（如P110）組成的異源二聚體。PI3K參與控制細(xì)胞的遷移和血管生成。PI3K產(chǎn)生的磷脂第二信使參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的多個(gè)步驟。PI3K可磷酸化和激活A(yù)kt，將其定位在

8、質(zhì)膜上[10]。
　　Akt是PI3K調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞遷移的主要下游靶因子。在人體內(nèi)有三種亞型:Akt1、Akt2和Akt3。PI3K產(chǎn)生的PIP3結(jié)合Akt并導(dǎo)致Akt的膜聚集，并通過(guò)其PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合磷酸肌醇依賴(lài)性蛋白激酶1(PDK1)，然后PDK1磷酸化Akt激酶結(jié)構(gòu)域[11]。為充分激活A(yù)kt，也需PDK2磷酸化AKT羧基端調(diào)節(jié)區(qū)域（AKT1在絲氨酸473位）。一旦激活，AKT就進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，產(chǎn)生一系列下游影響，如激

9、活CREB，抑制p27，將FOXO定位于細(xì)胞質(zhì)中，激活ptdins-3ps，影響P70和4EBP1的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致mTOR復(fù)合物的聚集和激活。mTOR調(diào)節(jié)核糖體蛋白S6激酶和真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1進(jìn)而引起翻譯起始因子eIF4E的釋放。糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，已有研究證明該激酶參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞程序性死亡，胚胎發(fā)生，調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律。
　　GSK-3β屬于保守絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，它的活性可以在

10、Tyr殘基被磷酸化后激活，而其活性會(huì)在Ser9殘基部位被磷酸化后抑制，多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)均有GSK-3β的參與，包括基因表達(dá)、代謝、和維持細(xì)胞骨架的完整性，GSK-3β是一種細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的負(fù)性調(diào)控因子[12]。
　　許多已知因素包括EGF，shh，IGF-1、胰島素和Cam等均可激活PI3K/Akt通路，而PTEN，HB9等可拮抗該通路表達(dá)[7,11,13-16]。越來(lái)越多的證據(jù)顯示，NSCSs與BMEC直接接觸共培養(yǎng)對(duì)PI3

11、K/Akt/GSK-3β/mTOR信號(hào)通路的影響可能增加了NSCs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用[9]。研究該通路在此過(guò)程中作用機(jī)制，可望為腦卒中的合理預(yù)防、逆轉(zhuǎn)提供重要依據(jù)。本課題擬通過(guò)體內(nèi)外的缺血缺氧模型探討神經(jīng)干細(xì)胞在卒中病變中的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制及PI3 K/Akt/GSK-3β/mTOR信號(hào)通路的影響。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.原代培養(yǎng)神經(jīng)元
　　2.不同濃度GSK-3β抑制劑TWS119不同濃度處理細(xì)胞，MTT法檢測(cè)神

12、經(jīng)元活性變化
　　3.MAP-2熒光染色后使用Image-J軟件計(jì)數(shù)神經(jīng)元突觸總長(zhǎng)度變化
　　4.Western Blot檢測(cè)Mcl-1、Bcl-2、Bax凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化
　　5.原代培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及胎鼠培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，將BMECs置于氧糖剝奪環(huán)境中，兩種細(xì)胞使用Transwell小室進(jìn)行間接共培養(yǎng)
　　6.Casepase-3凋亡相關(guān)酶活性及LDH酶活性檢測(cè)細(xì)胞損傷
　　7.Western

13、 Blot及q-rtPCR檢測(cè)PI3K/AKT/GSK-3信號(hào)通路表達(dá)變化
　　8.制作大腦中動(dòng)脈栓塞模型在SD大鼠中模擬缺血性腦梗，設(shè)置假手術(shù)組，NSCs治療組，動(dòng)物疾病模型組、PI3k抑制劑組進(jìn)行免疫組化染色等體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　9.行為學(xué)及TTC染色明確腦梗模型建立
　　10.HE染色、尼氏染色觀察神經(jīng)干細(xì)胞移植后腦組織形態(tài)學(xué)改變
　　11.MAP-2、GAP-43、Sinapsin-1染色觀察神經(jīng)元、突觸重塑情

14、況
　　12.IBA-1、GFAP免疫組化觀察小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞激活情況反映免疫激活狀態(tài)
　　13.Beclin-1、LC-3免疫組化檢測(cè)自噬活性
　　14.檢測(cè)細(xì)胞、動(dòng)物模型中炎癥因子表達(dá)變化
　　15.錯(cuò)步實(shí)驗(yàn)及黏膠移除實(shí)驗(yàn)進(jìn)行腦梗后行為學(xué)觀察。
　　結(jié)果：
　　1.MTT染色顯示細(xì)胞活性在氧糖剝奪環(huán)境中顯著降低，但GSK-3β抑制劑TWS119處理后神經(jīng)元活性提高
　　2.GSK-3

15、β抑制劑TWS119增加神經(jīng)元突觸總長(zhǎng)度
　　3.GSK-3β抑制劑TWS119能增加抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2的表達(dá)，而下調(diào)促凋亡蛋白Bax
　　4.GSK-3β抑制劑TWS119可使抗炎因子IL-10表達(dá)增加，而促炎因子IL-1β，IL-6及ICAM-1下降，炎癥因子IFN-γ表達(dá)未見(jiàn)明顯變化
　　5.原代培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞使用Transwell小室進(jìn)行間接共培養(yǎng)，其PI3K/AKT/GSK

16、-3信號(hào)通路磷酸化水平增高，Casepase-3凋亡相關(guān)酶活性及LDH酶活性檢測(cè)提示細(xì)胞損傷較單純?nèi)毖Ｐ图?xì)胞組減輕
　　6.制作大腦中動(dòng)脈栓塞模型在SD大鼠中模擬缺血性腦梗，設(shè)置假手術(shù)組，NSCs治療組，動(dòng)物疾病模型組進(jìn)行免疫組化染色等體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　7.大鼠行為學(xué)、TTC染色明確腦梗模型建立
　　8.HE染色、尼氏染色觀察神經(jīng)干細(xì)胞注射后腦組織核固縮、核碎裂及尼氏染色缺失等病理改變有所減輕
　　9.MAP-2、

17、GAP-43、Sinapsin-1染色觀察顯示細(xì)胞存活量在NSCs治療后明顯提高
　　10.IBA-1、GFAP免疫組化觀察NSCs能降低缺血損傷引起的炎癥反應(yīng)細(xì)胞激活，自噬活性也降低
　　11.NSCs治療后，動(dòng)物模型中炎癥因子L-Selectin，leptin，MCP-1及TNFα表達(dá)降低，抗炎因子TIMP-1表達(dá)升高
　　12.NSCs治療組大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中錯(cuò)步數(shù)及黏膠移除所需時(shí)間均有所減少
　　13.以上

18、變化可被PI3k抑制劑LY294002部分逆轉(zhuǎn)
　　結(jié)論：
　　抑制神經(jīng)元GSK-3β對(duì)氧糖剝奪環(huán)境下的神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)作用，提高神經(jīng)元活性，使神經(jīng)元突觸長(zhǎng)度變長(zhǎng)，抑制凋亡活性。機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生GSK-3β抑制作用的主要上游信號(hào)通路由PI3K/AKT介導(dǎo)，神經(jīng)干細(xì)胞能激活氧糖剝奪環(huán)境下BMECs中該通路，同時(shí)通過(guò)抗凋亡、抗炎、抑制自噬等作用促進(jìn)MCAO模型鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。這些作用部分被PI3K抑制劑LY294002所抵消，說(shuō)明神經(jīng)干