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1、目的:觀察胃泌素、曲妥珠單抗對(duì)胃癌細(xì)胞的協(xié)同增殖抑制作用,并研究胃泌素受體(Cholecystokinin B receptor,CCKBR)及其下游分子信號(hào)通路在協(xié)同抗腫瘤作用中的分子生物學(xué)機(jī)制。
方法:
1.在NCI-N87、SGC7901兩種胃癌細(xì)胞株中,通過細(xì)胞計(jì)數(shù)及克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察胃泌素、曲妥珠單抗對(duì)HER2陽性及HER2陰性胃癌細(xì)胞株的協(xié)同抗腫瘤作用,并通過流式細(xì)胞術(shù)觀察二者對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作用。
2、 2.在SGC7901細(xì)胞株中,予以胃泌素、曲妥珠單抗單藥及聯(lián)合用藥處理后提取蛋白Western-blot檢測(cè)CCKBR、AE1、AE2、P16、CyclinD1、β-catenin等相關(guān)蛋白表達(dá)水平改變,并通過核漿分離實(shí)驗(yàn)觀察p16蛋白在細(xì)胞漿、細(xì)胞核中的定位改變,研究CCKBR及其下游分子信號(hào)通路在協(xié)同抑制胃癌細(xì)胞增殖中所起的作用。
3.Western-blot檢測(cè)胃泌素、曲妥珠單抗對(duì)SGC7901、NCI-N87細(xì)胞中
3、CCKBR蛋白表達(dá)的影響;通過Realtime-PCR了解二者對(duì)CCKBR蛋白表達(dá)調(diào)控的機(jī)制,并通過CHX、MG132實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證二者對(duì)CCKBR蛋白穩(wěn)定性及泛素化水平的影響并闡明其協(xié)同上調(diào)CCKBR的分子生物學(xué)機(jī)制。在SGC7901中轉(zhuǎn)染pEGFP-CCKBR帶GFP標(biāo)簽的CCKBR過表達(dá)載體,進(jìn)一步觀察二者對(duì)CCKBR的膜定位的影響。
4.通過建立裸鼠成瘤在體模型觀察胃泌素、曲妥珠單抗的協(xié)同抗腫瘤作用,繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線;并取裸
4、鼠荷瘤組織開展免疫組織化學(xué)染色分析,觀察CCKBR的表達(dá)及膜定位的影響,提取蛋白后Western-blot檢測(cè)AE1、AE2、P16、CyclinD1等蛋白表達(dá)改變,在體研究胃泌素、曲妥珠單抗通過上調(diào)CCKBR抑制胃癌細(xì)胞增殖的分子生物學(xué)機(jī)制。
結(jié)果:
1.7種胃癌細(xì)胞株及永生化的正常的人類胃粘膜上皮細(xì)胞株GES-1中只有NCI-N87表達(dá)HER2蛋白,而CCKBR在大部分胃癌細(xì)胞株中均表達(dá)陽性。
2.曲妥
5、珠單抗對(duì)HER2陽性的NCI-N87細(xì)胞有明顯增殖抑制作用,對(duì)HER2陰性的SGC7901細(xì)胞無效。胃泌素對(duì)SGC7901、NCI-N87細(xì)胞均有增殖抑制作用,細(xì)胞計(jì)數(shù)及克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)在NCI-N87、SGC7901細(xì)胞中,胃泌素、曲妥珠單抗聯(lián)合用藥與單藥組相比有明顯協(xié)同腫瘤增殖抑制作用。流式細(xì)胞術(shù)提示胃泌素、曲妥珠單抗可協(xié)同阻滯SGC7901細(xì)胞于G0/G1期。
3.胃泌素、曲妥珠單抗可協(xié)同上調(diào)CCKBR蛋白,Real-t
6、ime PCR結(jié)果證實(shí)胃泌素、曲妥珠單抗不影響SGC7901細(xì)胞CCKBR mRNA水平,但CHX、MG132實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示胃泌素、曲妥珠單抗可協(xié)同增加CCKBR蛋白的穩(wěn)定性并降低CCKBR蛋白的泛素化水平。
4.Western-blot證實(shí)胃泌素、曲妥珠單抗可協(xié)同下調(diào)SGC7901細(xì)胞中p16、AE1、CyclinD1、β-catenin蛋白表達(dá),上調(diào)AE2蛋白,降低胞漿內(nèi)p16蛋白并促進(jìn)其入核。
5.裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)顯
7、示胃泌素、曲妥珠單抗在體內(nèi)亦有協(xié)同抗腫瘤作用,荷瘤免疫組織化學(xué)染色顯示聯(lián)合用藥組細(xì)胞膜CCKBR蛋白表達(dá)較單藥組明顯增多,荷瘤組織提取蛋白做Western-blot示胃泌素、曲妥珠單抗在體內(nèi)亦協(xié)同下調(diào)p16、AE1、CyclinD1蛋白、上調(diào)AE2蛋白,與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
結(jié)論:
1.胃泌素、曲妥珠單抗的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)對(duì)胃癌有協(xié)同抗腫瘤作用,并首次發(fā)現(xiàn)曲妥珠單抗在HER2陰性的胃癌細(xì)胞中同樣具有協(xié)同抑癌作用。
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