曲妥珠單抗對Her-2過表達乳腺癌細胞株mTOR信號通路的影響.pdf

1、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mTOR(mammaliantargetofrapamycin)是一種非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷酸肌醇激酶相關蛋白激酶家族(phosphoinositidekinase—relatedkinase，PIKK)，它對細胞生長、分化、增殖、遷移和存活都有重要調控作用。mTOR以兩種復合物形式存在，分別為mTORC1
　　 (mTOR-raptor復合物)和mTORC2(mTOR-rictor復合物)。

2、mTORC1由mTOR、Raptor(regulatory-associatedproteinofmTOR)、mLS8/GβL(Gproteipunit-likeprotein)、PRAS40和Deptor組成，受激素、生長因子、營養(yǎng)、能量、應激等刺激激活，并對雷帕霉素(rapamycin)敏感。mTORC1的激活導致下游信號40S核糖體蛋白激酶(40SribosomalproteinS6kinase(1)，S6K1)和真核細胞翻譯起始

3、因子4E結合蛋白(eukaryoticinitiationfactor-4Ebindingprotein1,4E-BP1)的磷酸化，從而參與調節(jié)細胞生長、增殖、存活、蛋白質翻譯、核糖體發(fā)生、自噬等重要生物學過程。mTORC2由mTOR、Rictor(rapamycin-insensitivecompanionofmTOR)、mLS8/GβL、mSin(l)(SAPKinteractingprotein1)、PRR5/Protor和Dep

4、tor組成，對雷帕霉素耐受。mTORC2可作用于Akt，但只針對Akt的Ser473位點，并不影響Akt其他位點。其活化Akt(S473)后可調控細胞的生存、代謝、增殖。另外有研究認為，mTORC2在如細胞骨架組織形成等各種生物過程中也有關鍵作用。
　　 有研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路在多種細胞生理活動如血管生成、胰島素抵抗、脂肪合成以及T淋巴細胞活化等中呈現(xiàn)過度活化狀態(tài)。也有研究認為，在炎癥反應中，mTOR信號通路的激活可以調控炎

5、癥。近年來，也有研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路在癌癥中高度激活，控制著眾多在腫瘤發(fā)生發(fā)展中至關重要的生物學過程，因此mTOR信號通路是近年來生命科學領域的研究熱點。而隨著研究的不斷深入，mTOR信號通路在多種常見腫瘤如乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、肺癌、白血病及淋巴瘤等發(fā)生發(fā)展中凸顯越來越重要的地位，盡管mTOR抑制劑雷帕霉素(rapamycin)及其類似物已經進入臨床試驗階段，但mTOR信號的調控機制仍處于探索階段，尚未能完全闡

6、明。
　　 乳腺癌是當今女性最常見惡性腫瘤之一，世界范圍內其發(fā)病率呈逐漸上升趨勢。在我國，乳腺癌發(fā)病率已位居大城市女性惡性腫瘤的第一位。Her-2是由位于染色體17q21的c-erbB2基因編碼的具有跨膜酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase，PTK)活性的跨膜糖蛋白，簡稱P185。臨床試驗證實，Her-2在15％～25％的乳腺癌中有基因擴增和蛋白過表達，使腫瘤細胞更易復發(fā)或轉移，無病生存期短，預后較差。曲妥珠單

7、抗(Trastuzumab)是以Her-2為靶點的重組人源化單克隆抗體，與c-erbB2受體細胞外區(qū)域結合，具有高度親和力和特異性阻斷c-erbB2受體而產生抗腫瘤效應?，F(xiàn)已廣泛用于治療Her-2過表達的乳腺癌患者。
　　 目前國內在曲妥珠單抗與mTORC1、mTORC2信號通路的關聯(lián)性上并無明確研究。本課題通過利用Her-2過表達的乳腺癌細胞株MDA-MB-453，旨在探討研究曲妥珠單抗對mTORC1、mTORC2信號通路的影

8、響，并觀察在mTOR信號通路的影響程度上曲妥珠單抗是否優(yōu)于雷帕霉素。
　　 目的：
　　 探討曲妥珠單抗對Her-2過表達乳腺癌細胞株mTOR信號通路的影響，并觀察在mTOR信號通路的影響程度上曲妥珠單抗是否優(yōu)于雷帕霉素。
　　 方法：
　　 Her-2過表達的乳腺癌細胞株MDA-MB-453為本實驗室保存，使用1640培養(yǎng)基，添加10％胎牛血清，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，根據細胞生長速度適時更換

9、培養(yǎng)基，用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA工作液消化分散細胞，進行傳代或接種培養(yǎng)。
　　 蛋白印跡(WesternBlot)檢測曲妥珠單抗對mTORC1和mTORC2信號通路的影響。將MDA-MB-453細胞接種于12孔板中，待細胞處于對數生長期后，在6組實驗組中加入濃度分別為0.25、0.5、1.0、1.5、2.5和5.0mg/ml的曲妥珠單抗，設1組空白對照組及1組雷帕霉素對照組(雷帕霉素的濃度為0.1mg/ml)，空

10、白對照組加入等量生理鹽水，孵育2h后提取蛋白，上樣，電泳分離，轉膜，室溫封閉1h，加一抗4℃孵育過夜，加二抗室溫孵育1h，ECL顯色，曝光，洗片。
　　 細胞增殖-毒性檢測試劑盒(CellCountingKit-8，CCK-8)檢測曲妥珠單抗對MDA-MB-453細胞增殖的影響。將生長狀態(tài)良好的MDA-MB-453細胞調整細胞濃度為2×104個/ml，接種于96孔板，每孔200μl，每組設5個平行孔。培養(yǎng)24h待細胞貼壁后，更換

11、新鮮培養(yǎng)基，分別為含生理鹽水的培養(yǎng)基(空白對照組1組)、含有0.1mg/ml雷帕霉素的培養(yǎng)基(雷帕霉素對照組1組)和含有濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.5和5.0mg/ml的曲妥珠單抗的培養(yǎng)基(實驗組5組)，繼續(xù)培養(yǎng)3天后，按CCK8試劑盒說明書操作，最后用酶標儀測吸光度值(λ=450nm)。
　　 平板克隆率試驗檢測在曲妥珠單抗的作用下乳腺癌細胞的克隆形成能力。將細胞接種于6孔板，每孔密度500個細胞，24h之后更換新鮮

12、培養(yǎng)基，1組空白對照組、5組實驗組培養(yǎng)基中分別加入生理鹽水和濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.5、5.0mg/ml的曲妥珠單抗。繼續(xù)進行培養(yǎng)，每48h更換1次新鮮培養(yǎng)基，維持培養(yǎng)2周，2周后終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，用PBS液沖洗2次，用甲醇室溫固定15min，棄去甲醇，用0.15％結晶紫染液室溫染色15min，用流水沖洗2次，室溫晾干，拍照統(tǒng)計克隆形成數。
　　 顯微鏡下觀察乳腺癌細胞死亡情況。將生長狀態(tài)良好的MDA-MB-4

13、53細胞調整細胞濃度為2×104個/ml，接種于24孔板，24h后待細胞融合密度達30％左右時，更換新鮮培養(yǎng)基，分別為含生理鹽水的培養(yǎng)基(空白對照組1組)、含有0.1mg/ml雷帕霉素的培養(yǎng)基(雷帕霉素對照組1組)、含有濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.5、5.0mg/ml的曲妥珠單抗的培養(yǎng)基(實驗組4組)和含有0.1mg/ml雷帕霉素及濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.5、5.0mg/ml的曲妥珠單抗的培養(yǎng)基(聯(lián)合用藥對照組4

14、組)，繼續(xù)培養(yǎng)。每天同一時段對每一孔進行隨機拍照，平均每孔三張照片，連續(xù)觀察6天。
　　 實驗數據均用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理。細胞增殖試驗、克隆形成試驗所有數據均用(x)±s表示。如果方差齊，采用方差分析(One-WayANOVA)多組間比較，然后采用LSD法進行兩兩比較，如果方差不齊，采用Welch法多組間比較，然后采用Dunnet'sT3方法進行兩兩比較。檢驗水準α=0.05。
　　 結果：
　　 We

15、sternBlot結果顯示:雷帕霉素對照組的mTOR、S6、4EBP1磷酸化明顯受抑制，實驗組隨曲妥珠單抗?jié)舛鹊脑龃?，mTOR、S6、4EBP1、Akt磷酸化水平越低，并且隨著曲妥珠單抗的濃度增大，其對乳腺癌細胞mTOR信號通路的抑制效果較之雷帕霉素組更加明顯。
　　 CCK8試劑盒檢測結果顯示:空白對照組OD值為1.79±0.07，雷帕霉素對照組OD值為1.47±0.08，曲妥珠單抗實驗組的OD值依濃度變化分別為1.37±0.

16、11、1.28±0.03、1.03±0.09、0.68±0.09、0.37±0.03，對上述5個實驗組和1個空白對照組進行方差齊性檢驗，6組數據的方差齊(P=0.083);方差分析的結果顯示，6組數據至少有2組的差異有統(tǒng)計學意義(F=221.863，P=0.000)。利用LSD法進行兩兩比較，與空白對照組相比，所有曲妥珠單抗實驗組均可抑制MDA-MB-453細胞增殖，差異具有統(tǒng)計學意義(均為P=0.000)。根據細胞相對增殖率公式可得曲

17、妥珠單抗實驗組的細胞相對增殖率依濃度變化分別為(77±6.3)％、(71±1.5)％、(57±4.9)％、(38±5.1)％、(21±1.5)％，而雷帕霉素對照組的相對增殖率為(82±4.6)％。與空白對照組相比，雷帕霉素對照組可抑制MDA-MB-453細胞增殖，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。
　　 6組克隆形成數據顯示:對照組與實驗組的均值分別為每孔(519±32)、(283±23)、(140±18)、(110±12)

18、、(83±10)和(19±6)個，克隆形成率分別為(100±6)％、(55±4)％、(27±3)％、(21±2)％、(16±2)％、(4±1)％。對上述6組克隆數據進行方差齊性檢驗，6組數據的方差齊(P=0.052);方差分析的結果顯示，6組數據至少有2組的差異有統(tǒng)計學意義(F=372.643，P=0.000)。利用LSD法進行兩兩比較，與空白對照組相比，所有曲妥珠單抗實驗組P=0.000。
　　 在顯微鏡下連續(xù)6天觀察細胞死亡

19、情況時發(fā)現(xiàn)，乳腺癌MDA-MB-453細胞為半懸浮圓形細胞，呈葡萄串樣生長。使用藥物6天后，不論是單藥曲妥珠單抗組還是聯(lián)合用藥組，細胞數目都隨曲妥珠單抗?jié)舛仍龃蠖鴾p少。但單用雷帕霉素從圖片上看并不比曲妥珠單抗效果好，聯(lián)合用藥圖片所見與曲妥珠單抗單藥效果相差也不大，并且2.5mg/ml曲妥珠單抗+0.1mg/ml雷帕霉素藥物組細胞數目卻比2.5mg/ml曲妥珠單抗藥物組多。
　　 結論：
　　 曲妥珠單抗作為針對Her-2