全反式視黃酸作用人肝癌細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)組學(xué)及其通過(guò)上調(diào)profilin1抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移機(jī)制的研究.pdf

1、全反式視黃酸(all-transretinoicacid，atRA)是目前公認(rèn)的對(duì)白血病可以起到有效治療作用的藥物，近些年來(lái)，鑒于其在多種類(lèi)型的白血病中的療效，很多學(xué)者也嘗試將其應(yīng)用于實(shí)體腫瘤的治療，并且取得了一定成果，肝癌也在其中之列。但目前對(duì)于atRA對(duì)肝癌的腫瘤抑制機(jī)制仍不完全清楚，哪些蛋白質(zhì)在此過(guò)程中起到關(guān)鍵作用值得進(jìn)一步的探討。 在本論文研究中，通過(guò)雙向凝膠電泳技術(shù)(two-dimensionalgelelectrop

2、horesis，2-DE)來(lái)尋找在atRA作用肝癌細(xì)胞后發(fā)生顯著變化的蛋白質(zhì)，并通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)(massspectrometry,MS)對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。本實(shí)驗(yàn)以人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721作為研究對(duì)象，用20μMatRA處理SMMC-7721細(xì)胞48小時(shí)后，應(yīng)用2-DE對(duì)atRA處理組和對(duì)照組細(xì)胞的總蛋白表達(dá)譜進(jìn)行了分析，對(duì)照組平均檢測(cè)到925~105個(gè)蛋白點(diǎn)(n=3)，atRA處理組平均檢測(cè)到970-~：33個(gè)蛋白點(diǎn)(n=3)。

3、將平行的對(duì)照組和atRA處理組的蛋白圖譜進(jìn)行匹配分析，平均匹配點(diǎn)數(shù)為690-~94個(gè)(n=3)，平均匹配率為72．47％。并通過(guò)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)了5個(gè)atRA處理后上調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)和16個(gè)處理后下調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。然后選擇了6個(gè)差異顯著(變化倍數(shù)>2)的蛋白質(zhì)，通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)搜索進(jìn)行了鑒定。這6個(gè)蛋白質(zhì)分別為細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白profilin1和F-actin加帽蛋白α1亞基，參與能量代謝的酶類(lèi)物質(zhì)磷酸甘油酸激酶1、α-烯醇化酶和吡哆醛激酶

4、剪切異構(gòu)體1以及核內(nèi)蛋白R(shí)uvB-like1，這些蛋白質(zhì)在atgA對(duì)腫瘤作用中的意義何在值得探討。由于已有部分文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白profilin1可能參與了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、遷移等過(guò)程，因此本論文選擇了atRA上調(diào)蛋白profilin1作為進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。 首先對(duì)通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)研究得到的profilin1變化結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。通過(guò)Westernblot實(shí)驗(yàn)證明了profilin1的蛋白表達(dá)水平隨著atRA作用劑量由5g

5、m至20gM的增加和作用時(shí)間由12至48小時(shí)的延長(zhǎng)而逐漸升高，提示profilin1的表達(dá)對(duì)atRA具有劑量和時(shí)間依賴(lài)性。同時(shí)，我們也選取了除SMMC-7721外的另三株肝癌細(xì)胞BEL-7402、BEL-7404和HepG2與正常肝細(xì)胞永生化細(xì)胞株L02細(xì)胞，對(duì)其中profilin1的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SMMC-7721、BEL-7402、BEL-7404和HepG2肝癌細(xì)胞中profilin1的表達(dá)水平分別低于正常肝細(xì)胞永生

6、化細(xì)胞L02中的表達(dá)水平52％、53％、38％和35％，證明profilin1的蛋白表達(dá)在多株肝癌細(xì)胞中均受顯著抑制。 為了解profilin1在atRA的腫瘤抑制過(guò)程中的作用，我們對(duì)atRA處理和過(guò)表達(dá)profilinl后肝癌細(xì)胞的增殖、遷移能力，以及分化相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行了初步的研究。首先通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染profilin1表達(dá)質(zhì)粒而使SMMC-7721細(xì)胞中profilinl過(guò)表達(dá)，然后對(duì)過(guò)表達(dá)profilin1的肝癌細(xì)胞、atRA

7、處理組以及對(duì)照組的SMMC-7721細(xì)胞的增殖和遷移能力、甲胎蛋白(AFP)含量和酪氨酸-(g-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶(TAT)活力進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，atRA可以顯著抑制細(xì)胞增殖和遷移，降低細(xì)胞內(nèi)AFP含量約7796、增強(qiáng)TAT活力4倍以上，而過(guò)表達(dá)profilin也能夠明顯抑制細(xì)胞增殖和遷移，降低細(xì)胞內(nèi)AFP含量約4096，增強(qiáng)TAT活力約2596。根據(jù)以上結(jié)果可推測(cè)，profilin1參與了atRA誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和遷移抑制過(guò)程，atRA