抗類風濕性關(guān)節(jié)炎滑膜血管新生的中藥藥效評價方法研究.pdf

1、類風濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性滑膜炎并侵蝕軟骨、最終導致骨與關(guān)節(jié)破壞為特征的世界難治性自身免疫性疾病。其發(fā)病率較高，世界約0.5～1％、我國約0.32～0.36％，致殘率也高，給社會和家庭帶來嚴重的負擔。RA的發(fā)病機制至今尚未完全闡明，也無特效療法。已知新生血管形成伴隨著滑膜增生和炎性細胞浸潤，是RA血管翳形成及關(guān)節(jié)破壞的基礎(chǔ)。臨床研究發(fā)現(xiàn)RA關(guān)節(jié)內(nèi)新生血管增生的程度與患者的病情、滑膜增生及

2、炎細胞浸潤的程度成正相關(guān)，通過抑制血管生成的藥物可以緩解RA的病情。因此，延緩甚至阻斷RA病人的滑膜血管新生已成為當前國際RA治療的有效策略之一。
　　RA既屬中醫(yī)的痹癥范疇，也屬中醫(yī)的絡(luò)病范疇，其病機與絡(luò)脈痹阻相關(guān)，為“毒損肢節(jié)絡(luò)脈、絡(luò)道亢變、絡(luò)脈虛滯”，這與RA的“滑膜炎癥-血管新生-損傷”的現(xiàn)代病機特點相似?，F(xiàn)代研究認為RA絡(luò)病的實質(zhì)與滑膜血管新生有關(guān)。中醫(yī)臨床研究顯示，具祛風勝濕、活血化瘀、蟲類搜風等“通絡(luò)開痹”功效的中藥

3、具有較好的抗RA滑膜血管新生作用。提示從中藥寶庫中開發(fā)具有抑制血管新生作用的抗風濕改善病情藥物(DMARDs)的可能。然而目前國內(nèi)外均未建立適合中藥整體作用特點的抗RA滑膜血管新生藥效機理評價方法，嚴重影響了具有抗RA滑膜血管新生作用的中藥新藥的研發(fā)，使其國際化進程受到限制。因此，積極探索和建立適合中醫(yī)藥的抗RA滑膜血管新生的藥效學評價方法是當前中醫(yī)藥治療RA研究中的重要課題。
　　本研究針對RA的病因病機特點以及滑膜血管形成的病

4、理機制，從RA單純疾病模型膠原誘導性關(guān)節(jié)炎(CIA)模型、RA病證結(jié)合模型(風寒濕證和風濕熱證)、細胞模型等方面，通過藥效評價、機理探討、檢測分析，構(gòu)建了抗RA滑膜血管新生的中藥藥效評價模型。并選擇雷公藤甲素、通絡(luò)開痹中藥復方(清絡(luò)飲和溫絡(luò)飲)和抗RA寒證經(jīng)典方劑(烏頭湯)作為干預，較好地探索了所建立的藥效評價方法的合理性和規(guī)范性。本研究所建立的抗RA滑膜血管新生的中藥藥效評價方法和模式，為其他同類中藥藥效評價方法的構(gòu)建提供有意義的參考

5、。
　　中藥藥效評價是中藥研究的難點。本研究建立的評價方法還有很多不足，有待進一步完善，如：沒有建立SCID-HuRAg嵌合體等可供動態(tài)觀察滑膜血管新生過程的整體動物模型以及血管內(nèi)皮細胞和RA滑膜成纖維細胞(RA-HFLS)共培育誘導滑膜血管生成過程的體外細胞模型。另外，所建立病證結(jié)合模型尚處于探索階段，如風寒濕或風濕熱等刺激因素的誘導能否直接導致與臨床RA風寒濕證或風濕熱證相同病理變化的產(chǎn)生等等，需要更深層次的研究。中藥整體調(diào)節(jié)

6、作用與現(xiàn)代的組學、系統(tǒng)生物學和網(wǎng)絡(luò)藥理學的系統(tǒng)特性相似，下一步可從網(wǎng)絡(luò)藥理學的角度進行相關(guān)研究。
　　具體研究內(nèi)容如下：
　　1抗RA滑膜血管新生中藥藥效評價模型建立。
　　本研究中，我們分別采用CIA敏感品系DA大鼠和非敏感品系SD大鼠成功復制了能反映RA I}缶床癥狀和滑膜血管新生病變的CIA，其中采用DA大鼠的造模成功率100％，SD大鼠的造模成功率87.5％，但與SD大鼠相比，DA大鼠價格昂貴來源極少，故價廉易

7、得的SD大鼠能大大降低抗RA新藥研發(fā)的成本，同樣適合于抗RA的藥物活性篩選，而且更適合于大規(guī)模的復制。
　　方證對應(yīng)是中藥發(fā)揮療效前提，需要采用中醫(yī)證的模型才能較好地評價中藥療效。本研究在RA單純疾病模型CIA的基礎(chǔ)上，給予動物一定的風寒濕或風濕熱條件干預，模擬中醫(yī)臨床“風、寒、熱、濕”等多種病因夾雜致病特點和“毒損絡(luò)脈”的病機特點，分別制作出RA的寒(風濕)證與熱(風濕)證模型，并根據(jù)中醫(yī)動物模型擬臨床主觀癥狀客觀化的研究思路，

8、從關(guān)節(jié)表面溫度、關(guān)節(jié)疼痛閾值、關(guān)節(jié)表面血流速度、全血粘度等這些符合中醫(yī)證型臨床客觀指標作為主要評判標準，建立針對模型寒熱證候特點的客觀評價指標體系。結(jié)果顯示，模擬病因制作的RA寒(風濕)證與熱(風濕)證動物模型，既有明顯的寒/熱證癥狀，又有明顯的RA特征。
　　針對滑膜血管形成的病理機制，我們建立了抗RA滑膜血管新生的體內(nèi)體外活性篩選模型，以便從深層次闡明藥物的作用靶點。包括：人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的增殖、遷移、黏附和管腔

9、形成實驗，RA-HFLS的增殖、遷移和黏附實驗；體內(nèi)單純血管生成模型--小鼠基質(zhì)膠栓實驗。其中，RA=HFLS攜帶RA滑膜炎癥反應(yīng)特有的遺傳信息，結(jié)合HUVEC能反映RA炎癥反應(yīng)對血管新生的影響。
　　2抗RA滑膜血管新生藥效評價指標建立。
　　從關(guān)節(jié)紅腫、畸形等臨床癥狀觀察、臨床積分、發(fā)病率、腫脹度、首次發(fā)病時間、關(guān)節(jié)滑膜組織炎性增生和炎癥細胞浸潤程度以及由其介導的關(guān)節(jié)損傷程度(關(guān)節(jié)組織病理學檢查和影像學技術(shù))等方面評價R

10、A藥效；通過關(guān)節(jié)滑膜組織血管新生情況(常規(guī)病理和血管內(nèi)皮細胞標志物CD31的免疫組化技術(shù))和基質(zhì)膠子中血管生成情況(組織病理學檢查)評價血管新生病變程度，從而建立抗RA滑膜血管新生藥效評價指標體。
　　3基于血管形成過程的抗RA滑膜血管新生作用機理評價指標建立。
　　針對滑膜血管形成的復雜過程和調(diào)控機制，觀察了體外培養(yǎng)的m.WEC和RA-HFLS的增殖、遷移、黏附和管腔形成能力，同時觀察了體外和/或體內(nèi)血管新生的調(diào)控通路VE

11、GF/VEGFR和Ang/Tie2及炎癥相關(guān)調(diào)控因子表達情況，從而構(gòu)建抗RA滑膜血管新生的藥物作用機理評價指標。
　　4抗RA滑膜血管新生中藥藥效評價方法的驗證。
　　以傳統(tǒng)抗RA中藥雷公藤的主要活性成分雷公藤甲素為驗證對象，通過CIA大鼠關(guān)節(jié)炎紅腫癥狀表現(xiàn)、臨床積分和發(fā)病率以及病理學檢查考察對RA的療效，采用組織病理學HE染色和CD31特染方法考察對滑膜血管新生的作用，并通過考察體外HUVEC和RA-HFLS的增殖、遷移、

12、黏附和管腔形成能力及血管新生調(diào)控通路因子的表達情況進行機理探討，結(jié)果顯示雷公藤甲素具有抑制RA滑膜血管新生的作用。通過雷公藤甲素比較全面的驗證，證明了所建立評價方法的規(guī)范性和合理性。
　　從RA“絡(luò)病”與血管增生的關(guān)系入手，通過具有“通絡(luò)”作用的寒、溫屬性不同的復方清絡(luò)飲、溫絡(luò)飲對大鼠CIA、小鼠基質(zhì)膠栓模型和體外RA-HFLS和HUVEC實驗及相關(guān)藥效和機理評價指標的驗證，結(jié)果顯示清絡(luò)飲抑制RA滑膜血管新生的作用優(yōu)于溫絡(luò)飲，初步

13、提示CIA可能具有RA脈絡(luò)瘀阻證的生物學表征，可能更適合于具有中醫(yī)治則治法的寒性中藥研究。
　　辨證論治是中醫(yī)藥發(fā)揮療效的前提。以CIA疾病模型為對照，通過抗RA寒痹證經(jīng)典方劑烏頭湯對RA寒(風濕)證的“對證”和RA熱(風濕)證的“不對證”的驗證，考察所建RA寒(風濕)證和熱(風濕)證模型的合理性和可靠性，結(jié)果顯示烏頭湯治療RA寒(風濕)證滑膜血管新生的作用優(yōu)于CIA，對熱(風濕)證模型沒有明顯作用，初步提示RA寒(風濕)證模型可

14、能一定程度地反映RA寒證證候特征，適合于具有明顯熱性中藥的研究。結(jié)合烏頭湯對RA寒(風濕)證模型的有效性和對熱(風濕)證的無效結(jié)果，提示中醫(yī)“療寒以熱”的合理性。
　　本研究的創(chuàng)新點：
　　1.從滑膜血管新生環(huán)節(jié)切入研究抗RA的中藥藥效評價方法學，具有較新的研究理念和較高的國際認可度，國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。
　　2.采用體內(nèi)和體外、局部和系統(tǒng)、形態(tài)和功能、藥效和機制相結(jié)合的研究模式建立相關(guān)藥效評價方法較符合中藥的整體作