禽致病性大腸桿菌Ⅰ型菌毛fimH基因缺失突變株的構(gòu)建及其相關(guān)功能性分析.pdf

1、禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)引起的一種常見的重要細(xì)菌性傳染病，且易與其它病原性細(xì)菌、病毒并發(fā)或混合感染，給世界范圍內(nèi)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 研究發(fā)現(xiàn)，與禽大腸桿菌毒力相關(guān)的致病因子主要有：I型菌毛、P型菌毛、卷曲菌毛、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、K抗原、補(bǔ)體抗性等。在上述大腸桿菌諸多致病因子中，菌毛對病原性大腸桿菌在易感動物機(jī)體內(nèi)的入侵、定居、增殖或釋放毒

2、力因子的感染和致病過程中起著重要的作用。95％雞致病性大腸桿菌菌株均可表達(dá)I型菌毛，I型菌毛是菌體復(fù)合蛋白，由主要結(jié)構(gòu)亞單位FimA和3個次要亞單位FimF、FimG及FimH組成。在I型菌毛的組成中，位于菌毛項(xiàng)部的粘附蛋白FimH，是I型菌毛和D-甘露糖受體特異性結(jié)合的粘附素(adhesin)，因此I型菌毛又稱甘露糖敏感性菌毛。 為探討I型菌毛特別是FimH在禽大腸桿菌病發(fā)病過程中起的作用，基于禽大腸桿菌I型菌毛黏附素fimH

3、基因的已知序列，利用九噬菌體Red重組系統(tǒng)對禽致病性大腸桿菌國內(nèi)分離株A2(血清型O2:K89)、CEl28(血清型O78:K89)、CEl29(血清型O1:K89)和1株禽源非致病性大腸桿菌C1(健康雛雞腸道分離株，血清型未鑒定)I型菌毛上的黏附fimH基因進(jìn)行敲除。其主要構(gòu)建步驟為：首先PCR擴(kuò)增出兩翼與fimH基因上下游序列同源，中問為氯霉素抗性基因的DNA片段，然后轉(zhuǎn)化入A2、CEl28 CEl29和C1，在Red重組系統(tǒng)表達(dá)重

4、組酶的幫助下，含氯霉素抗性基因的PCR產(chǎn)物通過其兩側(cè)的fimH基因同源序列與禽大腸桿菌染色體上的fimH基因發(fā)生同源重組，通過氯霉素抗性平板篩選得到陽性克隆，對篩選得到的陽性克隆再導(dǎo)入編碼Flp重組酶的質(zhì)粒pCP20，通過第二次重組去除抗性基因，結(jié)合PCR擴(kuò)增和測序鑒定，證明△fimH突變株A2△fimH、CEl28△fimH、CEl29△fimH、C1△fimH正確構(gòu)建。由于△fimH突變株染色體上的fimH基因序列大部分已缺失，從而

5、造成回復(fù)突變的可能性不大?；?株△fimH突變株構(gòu)建的基礎(chǔ)上，比較分析了4株△fimH突變株和其野生菌株的體外細(xì)胞粘附特性和其它部分相關(guān)生物學(xué)特性。通過豚鼠紅細(xì)胞和酵母細(xì)胞凝集試驗(yàn)結(jié)果表明，所有野生株呈現(xiàn)良好的凝集效果，并能被0.5％甘露糖溶液完全抑制，而所有的△fimH突變株未呈現(xiàn)任何凝集現(xiàn)象，進(jìn)一步通過fimH基因互補(bǔ)試驗(yàn)使△fimH突變株恢復(fù)了與野生株具有相同的凝集活性。豚鼠紅細(xì)胞和酵母細(xì)胞凝集試驗(yàn)證明，F(xiàn)imH蛋白是I型菌毛和

6、D-甘露糖受體特異性結(jié)合的粘附素，即I型菌毛為甘露糖敏感性菌毛。體外生長試驗(yàn)結(jié)果表明，△fimH突變株生長周期各個階段都要稍慢于野生株。雞嗜異性粒細(xì)胞和A549細(xì)胞(人肺上皮細(xì)胞)粘附試驗(yàn)表明，相對于野生菌與雞嗜異性粒細(xì)胞和A549細(xì)胞粘附的數(shù)量來說，△fimH突變株少于野生株。 利用λ噬菌體Red重組系統(tǒng)構(gòu)建的△fimH突變株染色體上的fimH基因序列大部分已缺失。已構(gòu)建的4株△fimH突變株與常規(guī)方法構(gòu)建的突變株相比，其4株