禽病原性大腸桿菌E058株和尿道致病性大腸桿菌U17株neuC、proP基因突變株的構(gòu)建及其致病性評價.pdf

1、禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌(avianpathogenicEscherichiacoli，APEC)引起的一種常見的局部或全身性感染的細菌性傳染病，且易與其它病原性細菌、病毒并發(fā)或混合感染。目前，該病已成為危害養(yǎng)禽業(yè)的重要細菌病，給養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴重威脅和造成重大經(jīng)濟損失。
　　 尿道感染(urinarytractinfections，UTIs)在人類疾病中是比較常見的，大部分婦女都會經(jīng)歷一次尿道感染。迄今，尿道致病性大腸桿菌

2、(uropathogenicEscherichiacoli,UPEC)是尿道感染中最常見的病原體。UPEC通過自身所帶的毒力因子黏附并侵入宿主，突破宿主的防御系統(tǒng)，引起組織的損傷。UPEC在腸道外的生長能力使得它們能引起尿道感染在內(nèi)的各種疾病。
　　 基于APEC和UPEC的致病潛能，APEC和UPEC被歸為新型致病性大腸桿菌—腸道外病原性大腸桿菌(extraintestinalpathogenicEscherichiacoli

3、，ExPEC)。由于APEC和UPEC在腸道外感染中可能會面臨宿主相似的挑戰(zhàn)，它們可能具有某些相似的致病基因和致病能力。很多研究證明，APEC和UPEC的毒力因子之間存在著一定的相似性。
　　 我們之前的研究利用DNA芯片分別對APECE058株和UPECU17株在雞體內(nèi)和體外的轉(zhuǎn)錄子進行了分析，結(jié)果顯示neuC基因呈顯著上調(diào)趨勢，同時我們通過選擇性捕獲轉(zhuǎn)錄序列方法得出proP基因可能跟致病性相關(guān)。因此，本研究中選擇構(gòu)建neuC

4、和proP這兩個基因的突變株并評價其與致病性之間的關(guān)系。
　　 運用Red重組系統(tǒng)構(gòu)建E058△neuC、U17△neuC、E058△proP、U17△proP基因缺失突變株。Southernblot結(jié)果顯示Kanamycin和Zeocin抗性基因在E058△neuC、U17△neuC和E058△proP、U17△proP質(zhì)粒中的插入是單拷貝的;RT-PCR結(jié)果表明E058△neuC和U17△neuC的neuC基因不能轉(zhuǎn)錄，E0

5、58△proP和U17△proP的proP基因不能轉(zhuǎn)錄，而相關(guān)基因的上下游基因的轉(zhuǎn)錄并未受影響。在血清殺菌實驗中，與野生株E058和U17相比，E058△neuC和U17△neuC在血清中的存活率下降(P＜0.05)，而E058△proP和U17△proP與野生株相似。巨噬細胞HD11的吞噬結(jié)果顯示，與野生株E058和U17相比，E058△neuC和U17△neuC突變株的吞噬率顯著升高，而E058△proP和U17△proP突變株的吞

6、噬率跟野生株相當。體內(nèi)競爭結(jié)果表明，在35日齡的SPF雞體內(nèi)，與野生株E058、U17相比，突變株E058△neuC和U17△neuC競爭性生長能力顯著下降（P＜0.001或P＜0.0001），說明突變株被高度致弱，但是E058△proP和U17△proP突變株和野生株E058和U17相比沒有差異。體內(nèi)動態(tài)分布實驗中，E058△neuC和U17△neuC突變株在受檢臟器中的細菌數(shù)較APECE058株和UPECU17株均明顯下降，其中在心