禽病原性大腸桿菌E058株iucD、ftsk基因突變株的構(gòu)建及其致病性評價(jià).pdf

1、禽大腸桿菌病(Avian Colibacillosis)是指部分或全部由禽病原性大腸桿菌(avian pathogenic Escherichia coli，APEC)引起的局部或全身性感染的疾病，包括大腸桿菌性敗血癥、大腸桿菌肉芽腫(Hjarre氏病)、氣囊病(慢性呼吸道病，CRD)、禽蜂窩織炎、腫頭綜合癥、腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎、全眼球炎及臍炎/卵黃囊感染。禽大腸桿菌病是2至12周齡雞和火雞的一種常見傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)

2、濟(jì)損失。大腸桿菌血清型復(fù)雜多樣，在APEC中最常見的血清型是O1、O2和O78。本研究旨在研究氣桿菌素家族的iucD基因以及功能未知基因ftsk與致病性之間的關(guān)系，了解iucD與ftsk突變株的生物學(xué)特性，為深入研究該病的致病機(jī)理和特異防制措施奠定基礎(chǔ)。 1.禽病原性大腸桿菌E058株iucD基因突變株的構(gòu)建及其治病性的研究 運(yùn)用等位基因交換的方法構(gòu)建iucD的基因缺失突變株。PCR擴(kuò)增iucD基因并將其插入到pBSK載

3、體的多克隆位點(diǎn)中，再運(yùn)用分子克隆的方法將Zeocin抗性基因插入到目的基因iucD中，構(gòu)建出帶Zeocin抗性基因標(biāo)志的載體pSK-iucD-Zeo，通過PCR擴(kuò)增片段iucD-Zeo，并電轉(zhuǎn)化入禽病原性大腸桿菌分離株E058中，根據(jù)同源重組原理，篩選出E058突變株E058iucD。 Southern blot的結(jié)果顯示Zeocin抗性基因在E058基因組或質(zhì)粒中的插入是單拷貝的；RT-PCR結(jié)果表明突變株的iucD基因不能轉(zhuǎn)

4、錄，而其上下游基因的轉(zhuǎn)錄未受到影響；E058iucD株較E058株在生長速度上幾乎沒有差別；在血清殺菌性實(shí)驗(yàn)中，突變株對SPF雞血清比野生株敏感；體內(nèi)外競爭實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，E058iucD株對E058株競爭力很弱；E058和E058iucD株的半數(shù)致死量(LD50)為分別為105.5 CFU和106.5 CFU；在35日齡SPF雞的致死性試驗(yàn)中，E058株所致死亡率為50％，而E058iucD突變株所致死亡率為16.5％(p<0.05)；

5、12日齡的SPF雞胚的致死性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，E058組死亡率為60％，而E058iucD組死亡率為35％(p<0.05)。上述結(jié)果揭示，iucD基因編碼的IucD與APEC E058株的致病性有關(guān)。 2.禽病原性大腸桿菌E058株ftsk基因突變株的構(gòu)建及其致病性研究 運(yùn)用基因重組的方法將卡那霉素抗性基因(kan)連接到PCR擴(kuò)增的ftsk兩端區(qū)域的2個(gè)基因片段之間，再插入到pBSK載體的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建出帶kan基因標(biāo)

6、志的載體pSK-F2-Kan-F1，通過PCR擴(kuò)增F2-Kan-F1片段，電轉(zhuǎn)化APEC分離株E058，根據(jù)同源重組原理，篩選出APEC E058 ftsk基因缺失突變株E058ftsk。 Southern blot結(jié)果顯示kan抗性基因片段在E058全基因組或質(zhì)粒中的插入并不是單拷貝的，而是插入了兩個(gè)拷貝；RT-PCR結(jié)果表明突變株的ftsk基因已經(jīng)不能反轉(zhuǎn)錄，而其上下游基因并未受到影響；生長曲線測定結(jié)果顯示，E058fts