基因槍法導(dǎo)入GUS基因誘導(dǎo)小麥條銹菌毒性突變的研究.pdf

1、小麥條銹病是世界各小麥產(chǎn)區(qū)最重要的病害之一，種植抗病品種是防治小麥條銹病最經(jīng)濟有效的措施，但是其病原小麥條銹菌(Puccinia striiformis f．sp．tritici)毒性變異頻繁，可以通過變異產(chǎn)生新的毒性小種，導(dǎo)致小麥品種抗病基因失效，引起小麥條銹病周期性流行危害。一般認(rèn)為小麥條銹菌毒性變異的主要途徑是基因突變和異核作用，其中基因突變是產(chǎn)生新的毒性基因的唯一途徑。因此，深入開展小麥條銹菌的致病相關(guān)基因的研究，對解決小麥品種

2、抗病性喪失問題有著十分重要的理論和實踐意義。本研究采用基因槍轉(zhuǎn)化法以帶有β-葡糖醛酸酶(GUS)報告基因的質(zhì)粒pGUS6L20轉(zhuǎn)化小麥條銹菌，進一步優(yōu)化條銹菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，分離和篩選小麥條銹菌毒性突變體，研究突變體的生物學(xué)特性。 獲得如下研究結(jié)果： 1.優(yōu)化了小麥條銹菌基因槍法轉(zhuǎn)化體系：為了提高基因槍的轉(zhuǎn)化率，本研究對CYR29遺傳轉(zhuǎn)化體系中主要參數(shù)進行了優(yōu)化，得到最優(yōu)體系為采用PDS-1000/He基因槍(Bio-Ra

3、d)，轟擊前小麥條銹菌夏孢子在4℃下萌動2～2.5h，每槍夏孢子用量為0.7mg，金粉(直徑為0.61xm)用量為350gg，質(zhì)粒DNA為1μg，最適轟擊壓力為1190 psi，較適轟擊壓力為900psi和1350psi，轟擊時真空度為2.7×104pa，爆裂膜與承載膜之間的距離為2.5cm，承載膜與阻擋網(wǎng)之間的距離為0.8cm，阻擋網(wǎng)與靶細(xì)胞之間的距離為6cm。 2.探索小麥條銹菌夏孢子轉(zhuǎn)GUS基因遺傳轉(zhuǎn)化體的分離方法：以從菌

4、種篩選品種上分離轉(zhuǎn)化體法為主，從繁殖品種輝縣紅上分離轉(zhuǎn)化體法為輔可有效提高轉(zhuǎn)化體的檢出率。同時本研究建立了利用透明膠帶粘取夏孢子并通過染色分離小麥條銹菌轉(zhuǎn)GUS基因轉(zhuǎn)化體的新方法。 3.獲得了GUS基因瞬時表達菌株和毒性突變菌株：采用基因槍轉(zhuǎn)化法以帶有β-葡糖醛酸酶(GUS)報告基因的質(zhì)粒pGUS6L20轉(zhuǎn)化小麥條銹菌CYR29，在轉(zhuǎn)化當(dāng)代條銹菌中得到了GUS瞬時表達的菌株；連續(xù)繼代轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后，在轉(zhuǎn)化后T1和T2代條銹菌中檢測到

5、了GUS基因穩(wěn)定表達的菌株；利用GUS報告基因和毒性標(biāo)記相結(jié)合的方法，經(jīng)過三代篩選鑒定在小麥條銹菌中國鑒別寄主尤皮Ⅱ號上獲得了MJ-4和MJ-7兩個穩(wěn)定的毒性突變體，在抗引655上獲得了MK-2和MK-3兩個穩(wěn)定的毒性突變體；4個突變菌株對篩選品種都發(fā)生了毒性突變，MK-2引起的反應(yīng)型變化為0→3型，MJ-4、MJ-7和MK-3引起的反應(yīng)型變化為0→4型。經(jīng)PCR及PCR-southern blot證實外源片段已整合到毒性突變菌株的基因