條銹菌誘導(dǎo)的小麥β-1，3-葡聚糖酶基因編碼區(qū)的克隆與原核表達(dá).pdf

1、β-1，3-葡聚糖酶是一類重要的病程相關(guān)蛋白(Pathogenesis-relatedproteins，PRs)，能催化β-1，3-葡聚糖多聚體(大多數(shù)植物病原真菌細(xì)胞壁的主要成份之一)的水解，從而抑制真菌的生長與增殖。銹菌與麥類作物互作關(guān)系的研究表明，在銹菌侵染與發(fā)育過程中，寄主細(xì)胞發(fā)生了一系列的防衛(wèi)反應(yīng)與病理變化，進(jìn)一步的生化分析證實寄主抗菌水解酶類在接種后增加迅速，并且含量明顯高于親和組合。本課題組前期利用源于大麥β-1，3-葡聚

2、糖酶基因cDNA(M62907)保守區(qū)的引物擴增得到條銹菌誘導(dǎo)的小麥β-1，3-葡聚糖酶基因片段，進(jìn)一步采用cDNA末端快速擴增技術(shù)(RapidAmplificationofcDNAEnds，RACE)獲得了該基因的cDNA全長。為進(jìn)一步研究該基因的功能及揭示其在小麥與條銹菌互作中的作用，本研究對條銹菌誘導(dǎo)的小麥β-1，3-葡聚糖酶基因編碼區(qū)進(jìn)行了克隆與原核表達(dá)。 1.根據(jù)前期獲得的小麥β-1,3-葡聚糖酶cDNA全長序列設(shè)計特

3、異引物，通過反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)獲得小麥β-1，3-葡聚糖酶基因的編碼區(qū)。 2.將其克隆至pGEMT-easyvector，獲得的重組質(zhì)粒GLU-pGEM-T用HindⅢ和BamHI進(jìn)行雙酶切，回收目的片斷定向克隆到表達(dá)載體pET-32a中，構(gòu)建的表達(dá)載體GLU-pET-32a轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)得到大小為49kDa的融合蛋白。 3.最佳誘導(dǎo)條件為：0.3mmol/LIPTG37℃誘導(dǎo)4h，表達(dá)

4、量約占菌體總蛋白的19％。 4.最佳誘導(dǎo)條件下融合蛋白以不溶的包涵體形式存在；0.01mmol/LIPTG20℃誘導(dǎo)20h可將可溶性融合蛋白的表達(dá)量提高至目的總蛋白的50％。 5.分別使用TritonX-100和尿素對以包涵體形式存在的融合蛋白進(jìn)行純化，尿素提取效果優(yōu)于TritonX-100，且尿素含量達(dá)到5mol/L時，基本可以去除雜蛋白的污染。 6.采用HisTrapHP親和層析柱，AKTA高壓液相層析系統(tǒng)對