小麥抗病基因同源序列分析及條銹菌誘導(dǎo)的防御酶活性研究.pdf

1、小麥條銹病是世界性的重要病害，嚴(yán)重威脅小麥生產(chǎn)。在我國(guó)，特別是西南麥區(qū)由于適宜的發(fā)病條件和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)造成的栽培品種和遺傳背景的單一化，使得條銹病成為我國(guó)小麥生產(chǎn)上最為嚴(yán)重的病害，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究以小麥新品種川農(nóng)17(R57)、川農(nóng)19(R88)、及其它抗病品種(系)為材料，以條銹菌水源14、條中32和流行生理小種混合菌為誘導(dǎo)菌種，采用生化分析方法，RGA分析技術(shù)，借助生物信息學(xué)分析手段，研究病原菌誘導(dǎo)后抗病相關(guān)防御酶系活性的變化

2、規(guī)律；并對(duì)小麥抗病相關(guān)的基因片段進(jìn)行分離、克隆，探討這些特異性片段結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；同時(shí)對(duì)四川省普遍使用的小麥抗病遺傳材料的抗病基因同源序列多樣性進(jìn)行分析，為進(jìn)一步闡明小麥抗病生化和分子機(jī)制，抗條銹病基因的分離、克隆，合理選擇小麥抗性親本提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下： 1病原菌誘導(dǎo)后抗、感小麥品種可溶性蛋白及防御酶系活性變化分析表明： 1)條銹菌水源14、條中32分別接種后，抗、感品種的可溶性蛋白含量在48h后出現(xiàn)高峰

3、，而混合菌種接種后可溶性蛋白含量高峰均推后到72小時(shí)。2)抗病品種的SOD活性在接種(單、混合菌種)后在0-24h內(nèi)均出現(xiàn)上升趨勢(shì)，感病品種的SOD活性在該時(shí)間段均出現(xiàn)不同程度的降低趨勢(shì)。3)抗病品種的POD活性在接種(單、混合菌種)后0-96h內(nèi)總體上呈上升趨勢(shì)，其最終活性均高于感病品種，而感病品種的POD變化呈現(xiàn)兩個(gè)峰值；混合菌系接種后POD活性的變化較單菌接種顯著。4)抗病品種的CAT活性在接種后0-24h迅速降低，此后略有回升，

4、R88CAT活性總體上高于R57；感病品種在整個(gè)過(guò)程中CAT活性變化不明顯；接種單菌系與混合菌系CAT活性變化無(wú)明顯差異。 2利用RT-PCR技術(shù)對(duì)小麥抗性材料進(jìn)行擴(kuò)增，共有78對(duì)RGA引物組合擴(kuò)增出清晰可辨譜帶，通過(guò)1.5％的瓊脂糖電泳共檢測(cè)出142條較強(qiáng)的條帶，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出1.82條。其中，引物Xal-NBS-F/Xal-NBS-R在R88品種(接種誘導(dǎo)48h)中擴(kuò)增出一條特異性條帶RGA702；引物XalLR-F/X

5、alLR-R在10N材料中(接種誘導(dǎo)24h和72h)均擴(kuò)增出另一條特異性條帶RGA200。序列分析表明：1)RGA702編碼的氨基酸序列與玉米、黑麥草及水稻的蛋白磷酸酯酶2A相似達(dá)95％以上，該序列編碼的產(chǎn)物可能參與植物抗病代謝過(guò)程。2)RGA200編碼的氨基酸序列與大麥、水稻、玉米的?；D(zhuǎn)移蛋白具有較高的相似性(＞76％)，但該序列含多個(gè)終止密碼子，推測(cè)其可能是一個(gè)假基因。 3根據(jù)小麥抗條銹病基因的NBS區(qū)域的保守結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)兩對(duì)

6、引物，其中一對(duì)引物Z1/Y2在小麥品種R88和4個(gè)黑麥材料的基因組中分別擴(kuò)增出2條長(zhǎng)度為344bp(R88)和341bp(黑麥)的特異性條帶。對(duì)其中的2個(gè)克隆RGAR88-1(R88)與RGARA-2(黑麥)序列比對(duì)分析，兩者核苷酸序列相似性高達(dá)94.7％，編碼的蛋白均具有NBS-LRR保守結(jié)構(gòu)，各含一個(gè)開(kāi)放閱讀框，與禾本科其它屬種的蛋白激酶、抗性蛋白復(fù)合體等具有較高的相似性，可能屬于NBS-LRR抗病基因家族。這兩條序列的GenBan

7、k登錄號(hào)為DQ494534和DQ494535。此結(jié)果表明，小麥新品種川農(nóng)19(R88)的高抗條銹病特性可能與黑麥特性片段插入有關(guān)，為其抗性的來(lái)源提供了初步的分子證據(jù)。 4通過(guò)RGAP方法對(duì)四川省主要利用的82份小麥抗病遺傳材料進(jìn)行了分析，篩選出多態(tài)性高的三對(duì)RGA引物組合：Ptokin1IN/Ptokin2IN、Cer31/XLRRINV2、AS3/S2，共獲得123條帶，其中54條帶具有多態(tài)性，多態(tài)率達(dá)43.9％。UPGMA分