T-cadherin在胃癌中的表達(dá)及其與VEGF、MVD之間關(guān)系的研究.pdf

1、目的：
　　胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，盡管其早期檢測(cè)技術(shù)和手術(shù)治療方式有很大的改進(jìn)，但死亡率依然很高。因此，尋找能夠精確代表腫瘤生物特性、篩選高危早期胃癌患者且能判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物非常重要，這些標(biāo)志物將會(huì)有助于更好地實(shí)施個(gè)體化治療。早期侵襲和轉(zhuǎn)移是胃癌的重要特征以及預(yù)后不良的關(guān)鍵因素也是腫瘤治療失敗的主要原因，新生血管的形成是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，腫瘤的早期局部浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移傾向，依賴(lài)于周?chē)M織的血供。因此血管生成與腫瘤有非常

2、密切的關(guān)系，針對(duì)血管生成的抗腫瘤治療正成為國(guó)際上的研究熱點(diǎn)，對(duì)腫瘤血管生成因子及其間相互作用的進(jìn)一步深入研究顯得尤為重要。在目前的研究中VEGF和MVD是反映腫瘤新生成血管很主要的兩個(gè)指標(biāo)[1]。在腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，無(wú)論是起始或終末階段，細(xì)胞粘附分子在血管生成均發(fā)揮著重要的作用，但是具體的作用機(jī)制尚不完全清楚。已有粘附分子E-cadherin的異常表達(dá)可以作為評(píng)價(jià)腫瘤預(yù)后的輔助指標(biāo)，同時(shí)可以誘導(dǎo)腫瘤血管的生成的相關(guān)報(bào)道[2]，但

3、是鮮見(jiàn)關(guān)于T-cadherin與胃癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和血管生成之間的研究。因此我們擬研究粘附分子家族中的T-cadherin與VEGF、MVD這兩個(gè)能夠反映胃癌形成過(guò)程中血管變化的兩個(gè)重要指標(biāo)之間的關(guān)系，以期能夠探討T-cadherin在胃癌形成過(guò)程中其與血管生成變化之間的關(guān)系，以此為臨床胃癌的診斷、指導(dǎo)治療及判斷預(yù)后提供依據(jù)
　　方法：
　　1.研究對(duì)象
　　標(biāo)本來(lái)源2011年10月至2012年12月在我院住院患者手

4、術(shù)切除的胃癌標(biāo)本80例。其中男性患者55人，女性患者25人。年齡30～84歲，平均年齡57.55歲。術(shù)前均未接收抗腫瘤治療。所有胃癌組織標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)（HE染色）證實(shí)為胃癌。癌旁組織取自距腫瘤邊緣2cm以上，并經(jīng)病理檢查排除腫瘤可能的組織標(biāo)本80例。取材后迅速制作成石蠟組織標(biāo)本保存?zhèn)溆谩?br>　　2.研究方法
　　采用免疫組化S-P法染色:1.取石蠟包埋的胃癌組織及相應(yīng)的癌周正常組織切塊，切片厚4微米，考片72度1.5小時(shí);2.

5、脫蠟:把切好的切片放入二甲苯中，10分鐘/缸共三缸;3.脫苯水化:酒精從高到低(95％-85％-75％)各五分鐘，切片放入水缸中用流水浸泡3分鐘;4蒸餾水清洗兩次，每次三分鐘;5.抗原修復(fù):T-cadherin和VEGF采用EDTA熱修復(fù)(100度20分鐘)，CD34采用高溫高壓修復(fù)（900ml水+82ml檸檬酸鈉+18ml檸檬酸當(dāng)高壓鍋氣閥頂起時(shí)記時(shí)1分20秒后停止）6.冷卻后每張切片滴一滴10％過(guò)氧化氫阻斷液（試劑A），以阻斷內(nèi)源性

6、過(guò)氧化氫酶的活性，室溫下孵育10分鐘。7..PBS液沖洗3次/3分。8.甩去PBS液，每張切片加一滴或50微升的非免疫性動(dòng)物血清（試劑B），室溫下孵育10分鐘。9.甩去血清，每張切片加一滴或50微升的第一抗體，室溫下孵育90分鐘或4度冰箱過(guò)夜。10 PBS液沖洗3次/3分。11.甩去PBS緩沖液，每張切片加一滴或50微升生物素標(biāo)記的第二抗體（試劑C），室溫下孵育20分鐘。12.PBS液沖洗3次/3分。13甩去PBS液，每張切片加一滴或5

7、0微升鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液（試劑D），室溫下孵育20分鐘。14.PBS液沖洗3次/3分。15甩去PBS液，每張切片加2滴或100微升新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察3-10分鐘，陽(yáng)性顯色為棕色。當(dāng)顯色恰當(dāng)時(shí)放入自來(lái)水中終止染色。16.自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染5分鐘，1％鹽酸酒精分化數(shù)秒（去掉多余著色部分），自來(lái)水沖洗(5min)返藍(lán)。17.切片經(jīng)過(guò)梯度酒精(75％-85％-95％-100％)脫水，中性樹(shù)膠封固。
　　3

8、、結(jié)果判斷
　　T-cadherin分子定位在細(xì)胞膜上，T-cadherin分子表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞膜被染成棕黃色，染色結(jié)果判斷方法為[3]:每張切片在100倍光鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)視野，400倍光鏡下每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比，取平均數(shù)，并以百分?jǐn)?shù)表示細(xì)胞陽(yáng)性指數(shù)。陽(yáng)性細(xì)胞＜10％為(-)，＞10％為(+)。VEGF以腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分[4]a（0分:無(wú)，1分:弱，2

9、分:中，3分:強(qiáng)）;和陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)b（0分:無(wú)，1分:1％～25％，2分:26％～50％，3分:51％～75％，4分:76％～100％）確定，a+b＞3，為陽(yáng)性，＜3為陰性。CD34結(jié)果判斷及MVD計(jì)算[1]:與胃癌細(xì)胞和其他組織成分有明顯區(qū)別染成棕黃色細(xì)胞或細(xì)胞叢作為一個(gè)血管，只要結(jié)構(gòu)不相連，分支結(jié)構(gòu)也作為一個(gè)血管計(jì)算。切片先置于低倍(HPFs×100)視野下確定最高血管密度區(qū)域，然后置于高倍(HPFs×200)視野下，選擇5個(gè)最高

10、血管密度區(qū)域計(jì)數(shù)（每個(gè)視野大小為0.075mm2），再取5個(gè)區(qū)域的平均值。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。T-cadherin、VEGF以已證實(shí)的陽(yáng)性表達(dá)的結(jié)腸癌標(biāo)本為陽(yáng)性對(duì)照，CD34以正常血管內(nèi)皮作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS緩沖液代替一抗作為陰性空白對(duì)照。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料的比較采用兩樣本比較的t檢驗(yàn)，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;計(jì)數(shù)資料的比較采用卡方檢驗(yàn)。各統(tǒng)計(jì)量均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)

11、學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、T-cadherin、VEGF和MVD在胃癌和癌旁正常胃組織中的表達(dá):T-cadherin主要在胃癌細(xì)胞膜上表達(dá)，陽(yáng)性率為45％(36/80)，而癌旁正常胃組織中T-cadherin陽(yáng)性率為62.5％(50/80)。兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026)。VEGF在癌旁正常細(xì)胞陽(yáng)性率為28.75％，在胃癌中表達(dá)陽(yáng)性率為71.25％之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。CD34陽(yáng)性細(xì)胞著色

12、部位主要是血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞膜和胞漿，胃癌中標(biāo)記的微血管明顯多于正常組織（54.957±7.277 vs27.5±6.096，P＜0.001）
　　2、胃癌中T-cadherin與VEGF、MVD表達(dá)的相關(guān)性分析:T-cadherin和VEGF蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P=0.001);T-cadherin陽(yáng)性組的MVD值明顯低于陰性低表達(dá)組(P＜0.001)
　　3、T-cadherin、VEGF、MVD在胃癌中的表達(dá)與臨床病理特征

13、的關(guān)系:T-cadherin、VEGF、MVD在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)與患者性別和年齡、大小均無(wú)關(guān)，(P＞0.05);而與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及pTNM分期呈明顯相關(guān)(P＜0.05)
　　結(jié)論：
　　1、T-cadherin主要在胃癌細(xì)胞膜上表達(dá)，陽(yáng)性率為45％(36/80)，而癌旁正常胃組織中T-cadherin陽(yáng)性率為62.5％(50/80)。兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026)。VEGF在癌旁正常細(xì)胞陽(yáng)性率為2

14、8.75％，在胃癌中表達(dá)陽(yáng)性率為71.25％之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。CD34陽(yáng)性細(xì)胞著色部位主要是血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞膜和胞漿，胃癌中標(biāo)記的微血管明顯多于正常組織(54.957±7.277vs27.5±6.096, P＜0.001)
　　2、T-cadherin和VEGF蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P=0.001); T-cadherin陽(yáng)性組的MVD值明顯低于陰性低表達(dá)組(P＜0.001)
　　3、T-cadherin