T-cadherin在胃癌中的表達及其與VEGF、MVD之間關(guān)系的研究.pdf

1、目的：
　　胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，盡管其早期檢測技術(shù)和手術(shù)治療方式有很大的改進，但死亡率依然很高。因此，尋找能夠精確代表腫瘤生物特性、篩選高危早期胃癌患者且能判斷預后的生物標志物非常重要，這些標志物將會有助于更好地實施個體化治療。早期侵襲和轉(zhuǎn)移是胃癌的重要特征以及預后不良的關(guān)鍵因素也是腫瘤治療失敗的主要原因，新生血管的形成是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，腫瘤的早期局部浸潤和轉(zhuǎn)移傾向，依賴于周圍組織的血供。因此血管生成與腫瘤有非常

2、密切的關(guān)系，針對血管生成的抗腫瘤治療正成為國際上的研究熱點，對腫瘤血管生成因子及其間相互作用的進一步深入研究顯得尤為重要。在目前的研究中VEGF和MVD是反映腫瘤新生成血管很主要的兩個指標[1]。在腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的過程中，無論是起始或終末階段，細胞粘附分子在血管生成均發(fā)揮著重要的作用，但是具體的作用機制尚不完全清楚。已有粘附分子E-cadherin的異常表達可以作為評價腫瘤預后的輔助指標，同時可以誘導腫瘤血管的生成的相關(guān)報道[2]，但

3、是鮮見關(guān)于T-cadherin與胃癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和血管生成之間的研究。因此我們擬研究粘附分子家族中的T-cadherin與VEGF、MVD這兩個能夠反映胃癌形成過程中血管變化的兩個重要指標之間的關(guān)系，以期能夠探討T-cadherin在胃癌形成過程中其與血管生成變化之間的關(guān)系，以此為臨床胃癌的診斷、指導治療及判斷預后提供依據(jù)
　　方法：
　　1.研究對象
　　標本來源2011年10月至2012年12月在我院住院患者手

4、術(shù)切除的胃癌標本80例。其中男性患者55人，女性患者25人。年齡30～84歲，平均年齡57.55歲。術(shù)前均未接收抗腫瘤治療。所有胃癌組織標本均經(jīng)病理學（HE染色）證實為胃癌。癌旁組織取自距腫瘤邊緣2cm以上，并經(jīng)病理檢查排除腫瘤可能的組織標本80例。取材后迅速制作成石蠟組織標本保存?zhèn)溆谩?br>　　2.研究方法
　　采用免疫組化S-P法染色:1.取石蠟包埋的胃癌組織及相應(yīng)的癌周正常組織切塊，切片厚4微米，考片72度1.5小時;2.

5、脫蠟:把切好的切片放入二甲苯中，10分鐘/缸共三缸;3.脫苯水化:酒精從高到低(95％-85％-75％)各五分鐘，切片放入水缸中用流水浸泡3分鐘;4蒸餾水清洗兩次，每次三分鐘;5.抗原修復:T-cadherin和VEGF采用EDTA熱修復(100度20分鐘)，CD34采用高溫高壓修復（900ml水+82ml檸檬酸鈉+18ml檸檬酸當高壓鍋氣閥頂起時記時1分20秒后停止）6.冷卻后每張切片滴一滴10％過氧化氫阻斷液（試劑A），以阻斷內(nèi)源性

6、過氧化氫酶的活性，室溫下孵育10分鐘。7..PBS液沖洗3次/3分。8.甩去PBS液，每張切片加一滴或50微升的非免疫性動物血清（試劑B），室溫下孵育10分鐘。9.甩去血清，每張切片加一滴或50微升的第一抗體，室溫下孵育90分鐘或4度冰箱過夜。10 PBS液沖洗3次/3分。11.甩去PBS緩沖液，每張切片加一滴或50微升生物素標記的第二抗體（試劑C），室溫下孵育20分鐘。12.PBS液沖洗3次/3分。13甩去PBS液，每張切片加一滴或5

7、0微升鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液（試劑D），室溫下孵育20分鐘。14.PBS液沖洗3次/3分。15甩去PBS液，每張切片加2滴或100微升新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察3-10分鐘，陽性顯色為棕色。當顯色恰當時放入自來水中終止染色。16.自來水沖洗，蘇木素復染5分鐘，1％鹽酸酒精分化數(shù)秒（去掉多余著色部分），自來水沖洗(5min)返藍。17.切片經(jīng)過梯度酒精(75％-85％-95％-100％)脫水，中性樹膠封固。
　　3

8、、結(jié)果判斷
　　T-cadherin分子定位在細胞膜上，T-cadherin分子表達陽性細胞的細胞膜被染成棕黃色，染色結(jié)果判斷方法為[3]:每張切片在100倍光鏡下隨機觀察10個視野，400倍光鏡下每個視野計數(shù)100個細胞中的陽性細胞數(shù)，計算陽性細胞百分比，取平均數(shù)，并以百分數(shù)表示細胞陽性指數(shù)。陽性細胞＜10％為(-)，＞10％為(+)。VEGF以腫瘤細胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，根據(jù)細胞染色強度評分[4]a（0分:無，1分:弱，2

9、分:中，3分:強）;和陽性細胞百分數(shù)b（0分:無，1分:1％～25％，2分:26％～50％，3分:51％～75％，4分:76％～100％）確定，a+b＞3，為陽性，＜3為陰性。CD34結(jié)果判斷及MVD計算[1]:與胃癌細胞和其他組織成分有明顯區(qū)別染成棕黃色細胞或細胞叢作為一個血管，只要結(jié)構(gòu)不相連，分支結(jié)構(gòu)也作為一個血管計算。切片先置于低倍(HPFs×100)視野下確定最高血管密度區(qū)域，然后置于高倍(HPFs×200)視野下，選擇5個最高

10、血管密度區(qū)域計數(shù)（每個視野大小為0.075mm2），再取5個區(qū)域的平均值。結(jié)果以均數(shù)±標準差表示。T-cadherin、VEGF以已證實的陽性表達的結(jié)腸癌標本為陽性對照，CD34以正常血管內(nèi)皮作為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗作為陰性空白對照。
　　4.統(tǒng)計學分析
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件，計量資料的比較采用兩樣本比較的t檢驗，采用均數(shù)±標準差表示;計數(shù)資料的比較采用卡方檢驗。各統(tǒng)計量均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計

11、學意義。
　　結(jié)果：
　　1、T-cadherin、VEGF和MVD在胃癌和癌旁正常胃組織中的表達:T-cadherin主要在胃癌細胞膜上表達，陽性率為45％(36/80)，而癌旁正常胃組織中T-cadherin陽性率為62.5％(50/80)。兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.026)。VEGF在癌旁正常細胞陽性率為28.75％，在胃癌中表達陽性率為71.25％之間差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。CD34陽性細胞著色

12、部位主要是血管內(nèi)皮細胞的胞膜和胞漿，胃癌中標記的微血管明顯多于正常組織（54.957±7.277 vs27.5±6.096，P＜0.001）
　　2、胃癌中T-cadherin與VEGF、MVD表達的相關(guān)性分析:T-cadherin和VEGF蛋白表達呈負相關(guān)(P=0.001);T-cadherin陽性組的MVD值明顯低于陰性低表達組(P＜0.001)
　　3、T-cadherin、VEGF、MVD在胃癌中的表達與臨床病理特征

13、的關(guān)系:T-cadherin、VEGF、MVD在胃癌組織中的陽性表達與患者性別和年齡、大小均無關(guān)，(P＞0.05);而與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及pTNM分期呈明顯相關(guān)(P＜0.05)
　　結(jié)論：
　　1、T-cadherin主要在胃癌細胞膜上表達，陽性率為45％(36/80)，而癌旁正常胃組織中T-cadherin陽性率為62.5％(50/80)。兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.026)。VEGF在癌旁正常細胞陽性率為2

14、8.75％，在胃癌中表達陽性率為71.25％之間差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。CD34陽性細胞著色部位主要是血管內(nèi)皮細胞的胞膜和胞漿，胃癌中標記的微血管明顯多于正常組織(54.957±7.277vs27.5±6.096, P＜0.001)
　　2、T-cadherin和VEGF蛋白表達呈負相關(guān)(P=0.001); T-cadherin陽性組的MVD值明顯低于陰性低表達組(P＜0.001)
　　3、T-cadherin