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文檔簡介
1、研究背景和目的:金黃色葡萄球菌中,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的感染危害嚴(yán)重,目前臨床抗生素療法已法完全控制MRSA感染,疫苗研制迫在眉睫。MRSA致病能力主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲酶的能力,金黃色葡萄球菌耐熱性腸毒素(SE),是引起人類食物中毒、全身炎癥反應(yīng)和膿毒癥休克的主要原因,其中 SEB在MRSA各菌株中序列相對保守,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。在小鼠模型研究中證實,SEB具有比其他抗原更好的體液應(yīng)答優(yōu)勢,人 SEB單克隆抗體可預(yù)防 M
2、RSA感染常見的毒性休克綜合癥。然而,SEB本身為毒素,用于人體存在安全隱患,因此,失去毒性的重組SEB突變子(rSEB)可能是MRSA疫苗良好的候選抗原。研究表明,SEB的免疫保護(hù)作用主要來自于抗體應(yīng)答,而機(jī)體的免疫應(yīng)答多集中針對免疫優(yōu)勢表位,抗原引起的保護(hù)性應(yīng)答實質(zhì)是特異的保護(hù)性表位的應(yīng)答。因此,對SEB抗原中保護(hù)性免疫優(yōu)勢表位的鑒定,是解析MRSA感染中SEB應(yīng)答的具體機(jī)制和優(yōu)化基于SEB的MRSA疫苗設(shè)計的重要前提。
3、目前已報道的SEB的B細(xì)胞表位的研究較少,對SEB的免疫優(yōu)勢的B細(xì)胞表位的全面分析尚未見報道,基于SEB免疫優(yōu)勢表位的疫苗研究也未見報道。本課題目的是系統(tǒng)篩選并鑒定SEB的B細(xì)胞免疫優(yōu)勢表位,并分析相應(yīng)優(yōu)勢表位的生物學(xué)功能;構(gòu)建并表達(dá)涵蓋SEB的免疫優(yōu)勢及亞優(yōu)勢B細(xì)胞表位的多表位融合蛋白疫苗,并評價其在抗MRSA感染中的保護(hù)作用。
方法:
第一部分: SEB的B細(xì)胞免疫優(yōu)勢表位篩選及其功能鑒定
1.因SEB
4、毒性與其超抗原活性密切相關(guān),為評價重組SEB突變子(rSEB)的毒性,用不同濃度的 rSEB或天然 SEB毒素分別刺激 BALB/c小鼠脾淋巴細(xì)胞,分析 rSEB刺激T細(xì)胞異常增殖及刺激脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2,IFN-γ及TNF-α的能力。
2.用AlPO4佐劑輔助SEB突變子( rSEB)免疫BALB/c小鼠,在三次免疫之后進(jìn)行MRSA252菌株的尾靜脈攻毒實驗,分析rSEB蛋白疫苗在預(yù)防MRSA252感染中的效果,并采集r
5、SEB免疫后小鼠的血清,分析血清中SEB抗體效價,評價SEB抗體應(yīng)答在MRSA感染中的作用。
3.合成覆蓋SEB全長的42條重疊18-肽,以上步獲得的SEB抗血清為一抗,用肽ELISA法分析各個重疊18-肽與SEB的結(jié)合能力,系統(tǒng)篩選與SEB具有優(yōu)勢結(jié)合能力的線性B細(xì)胞表位肽。以SEB全蛋白作為陽性對照,以無關(guān)肽OVA192-201和無關(guān)蛋白BSA作為陰性對照。用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS13.0作非配對T檢驗來分析各個吸光度值。
6、r> 4.在弗氏佐劑輔助下,用免疫優(yōu)勢18-肽-KLH的偶聯(lián)物免疫BALB/c小鼠,經(jīng)三次免疫后獲得表位肽抗血清。以 SEB天然毒素為包被抗原,用間接 ELISA法檢測不同稀釋度的表位特異性抗血清與SEB天然毒素的結(jié)合能力。
5.針對每個已篩選出的SEB免疫優(yōu)勢表位,從N-端及C-端分別依次截斷2個氨基酸,合成多個截斷肽,分別以截斷肽為包被抗原,以相應(yīng)優(yōu)勢表位肽抗血清為一抗,用間接ELISA法分析各個截斷肽與相應(yīng)18-肽抗血
7、清的結(jié)合強(qiáng)度,明確所篩選表位的核心序列。進(jìn)一步,表位肽抗血清以不同濃度稀釋,再次用ELISA法篩選與相應(yīng)抗血清結(jié)合最強(qiáng)的截斷肽,即優(yōu)勢表位核心序列。
6.在動物模型中獲得表位核心序列的抗血清,在體外進(jìn)行SEB毒素中和實驗,明確所篩選的SEB免疫優(yōu)勢表位的功能。在弗氏佐劑輔助下,用免疫優(yōu)勢表位核心序列-KLH偶聯(lián)物免疫 BALB/c小鼠,經(jīng)末次免疫后7天獲得表位核心序列的抗血清,在體外分析該表位核心序列的抗血清阻斷SEB毒素的刺
8、激T細(xì)胞增殖及脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ及TNF-α的能力。
7.在Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫中檢索不同金黃色葡萄球菌菌株來源的SEB氨基酸序列, NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行同源性比對,明確所篩選的SEB優(yōu)勢表位在不同金黃色葡萄球菌菌株中的序列保守性。在Pubmed protein data base數(shù)據(jù)庫中下載SEB晶體結(jié)構(gòu)圖,用PyMOL1.1軟件分析SEB免疫優(yōu)勢表位在SEB晶體結(jié)構(gòu)中的位置,分析SEB免疫優(yōu)勢表位在SEB
9、晶體結(jié)構(gòu)中的位置。
8.采用肽ELISA法分析SEB優(yōu)勢表位與臨床MRSA(+)血清的交叉反應(yīng)性,以此評價SEB優(yōu)勢表位在人體中的應(yīng)用前景。以SEB的優(yōu)勢表位為包被抗原以SEB抗血清為陽性對照,以臨床SEB抗體(-)血清為陰性對照。
第二部分:SEB的多表位疫苗制備及其保護(hù)功能評價
1.利用基因工程技術(shù)構(gòu)建含 SEB優(yōu)勢表位及亞優(yōu)勢表位的疫苗蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒,并在大腸桿菌 BL21(DE3)中表達(dá)重組 S
10、EB多表位融合蛋白;用 SDS-PAGE鑒定蛋白該表達(dá)形式;用Western Blot分析該蛋白的免疫原性及免疫反應(yīng)性;經(jīng)離子交換層析純化該蛋白;對蛋白進(jìn)行進(jìn)行N端氨基酸測序;用BCA法檢測蛋白濃度。
2.分別在弗氏佐劑及AlPO4佐劑輔助下,用SEB多表位蛋白或rSEB免疫BALB/c小鼠,三次免疫后經(jīng)尾靜脈對小鼠進(jìn)行 MRSA252菌株攻毒,分析不同免疫組小鼠在MRSA252感染后14天的生存狀態(tài),評價該疫苗對小鼠抗金黃色
11、葡萄球菌感染的保護(hù)效果。
3.用ELISA法檢測小鼠的抗血清滴度,分析各組疫苗免疫后特異性抗體的效價。ELISA法檢測SEB多表位疫苗的血清中抗SEBIgG抗體的水平,評價SEB多表位疫苗抗體應(yīng)答在中和SEB毒素中的作用。分別以疫苗中的各個表位為包被抗原,ELISA法檢測疫苗的抗血清與疫苗中每個表位的結(jié)合強(qiáng)度,評價疫苗中每個表位特異性抗體的應(yīng)答水平。
4.無菌收集不同免疫組存活小鼠的心、肝、肺及腎臟,研磨獲得各臟器組
12、織的懸液,選用生理鹽水作不同稀釋度稀釋,進(jìn)行細(xì)菌涂板,通過菌落計數(shù)、革蘭染色及PCR法計算各臟器中MRSA252的數(shù)量,評價在免疫攻毒后小鼠各臟器中細(xì)菌的定植量。
結(jié)果:
第一部分:SEB的B細(xì)胞免疫優(yōu)勢表位篩選及其功能鑒定
1.SEB突變子(rSEB)失去了SEB天然毒素的超抗原活性,不能刺激T細(xì)胞異常增殖,也不能刺激脾淋巴細(xì)胞分泌高水平的細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ及TNF-α。
2.用AlP
13、O4佐劑輔助rSEB免疫BALB/c小鼠,獲得了預(yù)防MRSA252感染的效果,產(chǎn)生了高水平的針對天然SEB的抗體。小鼠存活率達(dá)80%,顯著高于AlPO4佐劑組(20%)及PBS組(全部死亡)。免疫后血清中SEB抗體平均效價高達(dá)1:64000,顯著高于AlPO4佐劑組及PBS組。
3.在SEB的應(yīng)答中,IgG抗體應(yīng)答主要集中針對其中三個免疫優(yōu)勢B細(xì)胞18-肽,包括SEB97-114(NKNIDLFGTNYYYQCYFS), SE
14、B205-222(YETGYIKFIEGNGHSFWY)及SEB247-261(VESKSINVEVHLTKK)。其中SEB97–114及SEB247-261分別含有已報道表位SEB252-261(INVEVHLTKK)和SEB96-103(KNKNIDLF),因此,SEB205-222為本研究新發(fā)現(xiàn)的表位。
4.與正常血清作對照,SEB的三個優(yōu)勢表位肽特異性抗血清在不同稀釋度下,均能高效與SEB天然毒素進(jìn)行反應(yīng)(P<0.05
15、),尤其在抗血清稀釋度為1:1000和1:2000時最顯著(P<0.01)。
5.經(jīng)截斷肽ELISA及抗血清的濃度滴定法進(jìn)一步檢測,在SEB97–114組截斷肽中, SEB97–112相比其他截斷肽與 Anti-SEB97–114的結(jié)合能力最強(qiáng);在 SEB205–222組截斷肽中,SEB205–222相比其他截斷肽與 Anti-SEB205–222的結(jié)合能力最強(qiáng);在SEB247–261組截斷肽中,SEB247–261相比其他截
16、斷肽與 Anti-SEB247–261的結(jié)合能力最強(qiáng)。因此,免疫優(yōu)勢表位 SEB97–114、SEB205-222及 SEB247-261的核心序列分別為SEB97–112、 SEB207-222及SEB247-257。
6.在體外,SEB三個免疫優(yōu)勢表位的抗血清Anti-SEB97–114、Anti-SEB205-222及Anti-SEB247-261均可中和天然SEB毒素的刺激T細(xì)胞異常增殖及刺激脾淋巴細(xì)胞分泌高水平的細(xì)胞
17、因子IL-2、IFN-γ及TNF-α的能力。
7.同源性分析顯示,SEB97–112及SEB207-222氨基酸序列保守,SEB247-257氨基酸序列非保守;三維晶體結(jié)構(gòu)圖中顯示,SEB97–112位于SEB內(nèi)部的Loop區(qū),SEB207-222及SEB247-257SEB外部的β-片層。
8.SEB97-112與14/14的人MRSA(+)血清有交叉反應(yīng),SEB207-222與13/14的人MRSA(+)血清有交
18、叉反應(yīng),SEB247-257與14/14的人MRSA(+)血清有交叉反應(yīng)。
第二部分:SEB的多表位疫苗制備及其保護(hù)功能評價
1.構(gòu)建并獲得了含 SEB三個優(yōu)勢表位及三個亞優(yōu)勢表位的 SEB多表位融合蛋白。經(jīng)鑒定,該蛋白為包涵體表達(dá),經(jīng)純化后的蛋白純度大于95%,SEB多表位融合蛋白具有良好的免疫原性及免疫反應(yīng)性, SEB多表位融合蛋白的N端氨基酸序列與目的蛋白一致。經(jīng)純化的SEB多表位融合蛋白濃度為2.924 mg
19、/mL。
2.分別在弗氏佐劑及AlPO4佐劑輔助下,用SEB多表位融合蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠,免疫三次后小鼠獲得了對 MRSA252的抗感染保護(hù)能力。SEB多表位融合蛋白疫苗組的免疫保護(hù)效果優(yōu)于 rSEB全抗原組的免疫保護(hù)效果,尤其在 AlPO4佐劑輔助下,表位疫苗組小鼠抗MRSA252感染的存活率高達(dá)100%。
3.SEB多表位融合蛋白疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了高效價的抗體,特別是在AlPO4佐劑下,SEB多表位融合
20、蛋白疫苗組產(chǎn)生的抗體平均效價高達(dá)1:736000。SEB多表位融合蛋白疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的抗體能夠識別天然SEB毒素,在不同佐劑輔助時,SEB多表位疫苗產(chǎn)生的抗SEB IgG抗體水平有差異。該SEB多表位融合蛋白疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的抗體在不同程度上特異性地識別了各個表位,且各個表位的協(xié)同可能發(fā)揮更好的抗MRSA感染的作用。
4.免疫攻毒后,存活小鼠的各個臟器中,腎臟定植的MRSA細(xì)菌量顯著高于心、肝、肺。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,小鼠抗MRS
21、A感染存活率與各個臟器細(xì)菌定植量成負(fù)相關(guān)。
結(jié)論:
本實驗通過重疊肽ELISA、B細(xì)胞表位特異性抗體的中和毒素活性試驗、抗原表位的生物信息學(xué)及臨床血清學(xué)分析,篩選并鑒定出了SEB的三個免疫優(yōu)勢應(yīng)答B(yǎng)細(xì)胞表位,揭示了SEB體液免疫在抗MRSA感染中的保護(hù)機(jī)制,不僅發(fā)現(xiàn)了SEB的新表位SEB207-222,而且揭示了已報道的SEB表位的核心序列SEB97-112及SEB247-257。通過基因工程技術(shù)構(gòu)建并獲得了SEB多
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