微孔板式化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素B方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、金黃色葡萄球菌腸毒素(staphylococcal enterotoxin,SE)是金黃色葡萄球菌分泌的細(xì)菌外毒素。SE主要分為SEA、SEB、SEC、SED、SEE五型，SEC可分為SEC1、SEC2和SEC3三種亞型。有學(xué)者將中毒性休克綜合征毒素(toxic shock syndrome toxin 1,TSST-1)稱(chēng)為SEF。SE各型的分子量相近，約為26～30kDa，在高溫條件下和經(jīng)過(guò)蛋白水解酶的作用后，SE仍可保持生物學(xué)活性

2、。各型SE在結(jié)構(gòu)和功能上具有相似性。隨著新的檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，一些新型SE或與SE引起的食物中毒有密切相關(guān)的毒素相繼被發(fā)現(xiàn)。腸毒素是根據(jù)其引起嘔吐的性質(zhì)來(lái)命名的，已經(jīng)確定與嘔吐反應(yīng)有關(guān)的新型腸毒素分別是SEG、SEH和SEI，另有與SE食物中毒有密切相關(guān)的毒素(SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN、SEO、SEP、SEQ、SER、SEU和SEV)，其致吐作用尚未確定，這些相關(guān)毒素被命名為“staphylococcal entero

3、toxin-like(SEl)SAgs”，即“金黃色葡萄球菌腸毒素樣超抗原”，上述相關(guān)毒素可稱(chēng)為SElJ-SElV。
　　SE最突出的特點(diǎn)是具有超抗原活性。超抗原(Superantigen,SAg)指具有絲裂原作用，僅需要極低濃度（1～10ng/ml）就可以激活2％～20％T細(xì)胞克隆，使淋巴細(xì)胞增殖，產(chǎn)生極強(qiáng)的免疫應(yīng)答的一類(lèi)抗原。SAg可分為T(mén)細(xì)胞超抗原和B細(xì)胞超抗原。T細(xì)胞超抗原可根據(jù)其作用的T細(xì)胞受體類(lèi)型分為T(mén)CRγδ型超抗原

4、和TCRαβ型超抗原，SE屬于TCRαβ型超抗原。SE對(duì)免疫系統(tǒng)有免疫激活作用，其分子的一端與抗原提呈細(xì)胞上MHCII類(lèi)分子抗原結(jié)合溝槽α螺旋的外側(cè)結(jié)合，另一端同T細(xì)胞表面TCR的某些Vβ基因編碼片段結(jié)合，形成MHCII類(lèi)分子-SE-TCRVβ三重復(fù)合物。MHCII類(lèi)分子和SE組成的復(fù)合體與TCR結(jié)合不緊密，SE激活一個(gè)T細(xì)胞后解離可激活其它的T細(xì)胞，這樣就使得少量SE能夠激活多克隆的T細(xì)胞。T細(xì)胞被激活后，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，如IFN-

5、γ、IL-2、CSF和TNF-α等，參與某些病理過(guò)程的發(fā)生和發(fā)展。
　　不同金黃色葡萄球菌菌株產(chǎn)生的SE種類(lèi)差別較大，同一菌株可產(chǎn)生多種SE。另一方面，不同腸毒素基因序列間相似性較高，部分毒素基因存在密切的連鎖關(guān)系。為充分認(rèn)識(shí)和理解各型腸毒素的致病機(jī)理，需要對(duì)不同菌株中各型毒素的分布、各毒素基因型間的關(guān)系、毒素蛋白的表達(dá)和性質(zhì)進(jìn)行深入細(xì)致的研究。
　　SE引起的食物中毒在細(xì)菌性食物中毒中占有很高的比例。SEB的半數(shù)致死劑量(

6、LD50)約20ng/kg，半數(shù)有效劑量(ED50)約0.4ng/kg可以致殘。SEB性質(zhì)穩(wěn)定，而且易于制備，能夠以氣溶膠的形式散布。SEB被美國(guó)疾病控制中心確定為B類(lèi)生物戰(zhàn)劑。因此，在食物、水源和人的體液中能檢測(cè)出低劑量SEB的高靈敏度和高特異性的方法對(duì)食品安全衛(wèi)生和反恐怖戰(zhàn)爭(zhēng)具有十分重要的意義。
　　隨著對(duì)SE研究的日益深入，檢測(cè)SE的方法也得到不斷的發(fā)展和提高，向著高特異性、高靈敏度、簡(jiǎn)便、快速的方向發(fā)展。傳統(tǒng)的方法，如反向

7、被動(dòng)乳膠凝集法(RPLA)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence technique)等，由于靈敏度較低，其應(yīng)用受到了很大的限制。Khreich等使用免疫熒光技術(shù)能夠在檢測(cè)緩沖液中檢測(cè)到的0.02ng/mL的SEB。近年來(lái)，建立在抗原抗體相互作用基礎(chǔ)上的生物傳感器技術(shù)在檢測(cè)SEB領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。如表面等離子共振生物傳感器(Surface plasmon resonancebiosensor

8、,SPR)、共振聲譜分析（Resonant acoustic profiling,RAP）、生物半導(dǎo)體技術(shù)(Biological semiconductors,BSCs)、流動(dòng)注射電容生物傳感器(Flow-injection capacitive biosensor)等。生物傳感器檢測(cè)靈敏度高，如流動(dòng)注射電容生物傳感器能檢測(cè)到最低劑量為0.3pg/ml的SEB，但生物傳感器價(jià)格昂貴，不適合進(jìn)行高流通量檢測(cè)，目前主要應(yīng)用于科學(xué)研究。

9、>　　化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)法(Chemiluminescent immunoassay,CLEIA)因其具備靈敏度高、較寬的線(xiàn)性動(dòng)力學(xué)范圍以及簡(jiǎn)便快速等特點(diǎn)，現(xiàn)已得到廣泛應(yīng)用，其靈敏度可以和放射免疫檢測(cè)相媲美。CLEIA的基本原理是化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度和反應(yīng)物或產(chǎn)物的濃度呈正比。CLEIA是建立在抗原抗體復(fù)合物基礎(chǔ)之上，因此具有極高的特異性和靈敏度。CLEIA中常使用的標(biāo)記物有辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)等。
　　抗體

10、和酶是影響CLEIA靈敏度的兩個(gè)關(guān)鍵因素。我們篩選出一對(duì)特異性強(qiáng)的抗體配對(duì)，使用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體，利用魯米諾作為發(fā)光底物，建立了具有高度靈敏的微孔板式CLEIA檢測(cè)SEB的方法。微孔板式CLEIA與電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)和生物傳感器相比，具有操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，檢測(cè)速度快，約2分鐘就可以完成一塊96空板的檢測(cè)，能滿(mǎn)足需要高通量運(yùn)行的臨床檢測(cè)的需要。
　　本研究中，我們使用常規(guī)方法制

11、備了20株針對(duì)SEB分子的單克隆抗體，并進(jìn)行了腹水效價(jià)測(cè)定和抗體表位鑒定，從中篩選出兩株效價(jià)高、特異性強(qiáng)，識(shí)別不同表位組的兩株單抗組成抗體配對(duì)，并對(duì)CLEIA的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。本方法的線(xiàn)性動(dòng)力學(xué)范圍在0.01-5ng/mL之間，實(shí)際可測(cè)的檢測(cè)限(limit of detection,LOD)達(dá)到0.01ng/mL，批內(nèi)和批間變異均小于13％。本方法特異性強(qiáng)，與SEA、SEC1和SED之間不存在交叉反應(yīng)，可用于不同基質(zhì)中SEB的檢測(cè)，