應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記對(duì)雁鵝遺傳多樣性的研究.pdf

1、雁鵝原產(chǎn)于安徽省六安地區(qū),現(xiàn)主要分布于安徽省宣城市郎溪縣境內(nèi),是我國(guó)現(xiàn)存的極其珍稀的中型灰鵝品種,已被農(nóng)業(yè)部列為重點(diǎn)保護(hù)的地方品種。 簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間(Inter-simple sequence repeat, ISSR)標(biāo)記技術(shù)最早是Zietkiewicz(1994)提出的一種簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記。它是在SSR(Simple sequence repeat, SSR)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,以PCR技術(shù)為基礎(chǔ),利用真

2、核生物基因組中廣泛存在的SSR來設(shè)計(jì)引物,無需預(yù)先克隆和測(cè)序,從而對(duì)位于反向排列、間隔不太大的重復(fù)序列間的基因組片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)電泳分離獲得多態(tài)性圖譜。該實(shí)驗(yàn)技術(shù)成本低,特異性強(qiáng),實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性較高,所需DNA量少,引物設(shè)計(jì)比SSR簡(jiǎn)單,不需要知道SSR兩端的堿基序列,多態(tài)性高。 本試驗(yàn)以來自安徽省郎溪縣雁鵝原種鵝場(chǎng)的雁鵝為研究材料,應(yīng)用ISSR技術(shù)對(duì)雁鵝種群的譜系和遺傳多樣性進(jìn)行了探討。本研究的結(jié)果將在分子水平上的

3、提供雁鵝種質(zhì)特性的有關(guān)資料,并且可在一定程度上應(yīng)用于雁鵝保護(hù)的實(shí)際工作。所得結(jié)果如下： (1)建立了雁鵝ISSR-PCR分子標(biāo)記技術(shù)最佳反應(yīng)體系。以雁鵝基因組DNA為模板,采用正交設(shè)計(jì)L25(55)對(duì)PCR反應(yīng)中5個(gè)因素(引物、dNTPs濃度、模板DNA、Mg2+、TapDNA聚合酶)在5個(gè)水平上進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn),在初步實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過因素內(nèi)比較進(jìn)一步優(yōu)化各因素在ISSR-PCR反應(yīng)中的濃度。在25μL的反應(yīng)體系中,ISSR引物的濃

4、度為0.20μmol/L,dNTPs濃度為0.28mmol/L,模板DNA的用量為40ng,Mg2+濃度為1.5 mmol/L,TaqDNA聚合酶的用量為1.0U。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃變性5min,進(jìn)行下列35個(gè)溫度循環(huán)：94℃變性1min,退火溫度(55℃左右)1min,72℃延伸1min,最后在72℃延伸10min,擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃保存。 (2)對(duì)各個(gè)引物最佳反應(yīng)體系確立之后,篩選出43個(gè)ISSR引物,對(duì)94個(gè)供試樣本進(jìn)行了擴(kuò)增,

5、共擴(kuò)增出216個(gè)位點(diǎn),每條引物擴(kuò)增出的譜帶數(shù)在2～7之間,平均為5.0條；各譜帶分子量在150bp～2000bp之間。43條引物擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶共計(jì)145條,占總帶數(shù)的67.13％,多態(tài)條帶比率在16.67～100％之間,平均為65.60％。 (3)根據(jù)ISSR圖譜計(jì)算任意兩個(gè)個(gè)體之間的相似性系數(shù)和遺傳距離,構(gòu)建了由94只個(gè)體組成的雁鵝種群的遺傳距離矩陣,并根據(jù)該矩陣,用不加權(quán)算術(shù)平均組對(duì)法(Unweighted pair g

6、roup mothed with arithmeticmean, UPGMA)對(duì)94個(gè)個(gè)體間的關(guān)系進(jìn)行聚類分析,由此構(gòu)建了雁鵝種群的譜系圖。 (4)本研究首次采用ISSR這一核基因DNA標(biāo)記技術(shù)對(duì)雁鵝群體遺傳變異進(jìn)行了分析研究。ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在雁鵝種群表現(xiàn)出高度的穩(wěn)定性,并檢測(cè)到比RAPD等其它分子標(biāo)記更多的多態(tài)位點(diǎn)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,也較少出現(xiàn)由于隨機(jī)因素造成擴(kuò)增反應(yīng)不穩(wěn)定的情況,這充分說明ISSR技術(shù)用于分析雁鵝的