Ⅰ型鴨肝炎病毒A66弱毒株全基因組分析及逆轉(zhuǎn)錄套式PCR方法的建立.pdf

1、鴨病毒性肝炎(duck viral hepatitis, DVH)是由鴨肝炎病毒(duck hepatitis virus, DHV)引起的雛鴨一種高度致死和傳播性的病毒性傳染病。 根據(jù)GenBank中已登錄的I型DHV全基因組序列03D株和C80株,采用PrimerPremier 5.0軟件設(shè)計(jì)并合成了覆蓋整個(gè)全基因組6對(duì)特異的引物。利用RT-PCR方法擴(kuò)增I型DHV弱毒株A66全基因組的各片段,其中,病毒基因組3'末端序列的

2、擴(kuò)增是通過(guò)RACE方法獲得。將擴(kuò)增產(chǎn)物分別克隆于pMD-19T載體中進(jìn)行測(cè)序,并利用DNAStar軟件對(duì)A66株進(jìn)行序列分析,結(jié)果如下： 本研究對(duì)I型DHV A66弱毒株進(jìn)行了全基因組測(cè)定(GenBank登錄號(hào)：DQ886455)。研究結(jié)果表明,不含poly(A)尾巴的A66株的基因組全長(zhǎng)為7704個(gè)核苷酸殘基,包括626個(gè)核苷酸殘基的5'端非編碼區(qū)(5UTR)、6750個(gè)核苷酸殘基的開(kāi)放閱讀框(ORF)和314個(gè)核苷酸殘基的3

3、'非編碼區(qū)。將A66株與GenBank公布的其它DHV-I全基因序列進(jìn)行同源性比較分析,結(jié)果顯示,除了90D和04G兩株變異參考株外,A66株全基因組的核苷酸序列與其它參考株的核苷酸序列同源性在94.5％～99.7％；A66株ORF的核苷酸序列與其它參考株的核苷酸序列同源性在94.3％～99.7％,氨基酸序列的同源性在97.3％～99.6％。證實(shí)I型DHV病毒基因組的一級(jí)結(jié)構(gòu)高度保守。 根據(jù)毒株間全基因組、ORF和VP1基因的核

4、苷酸和氨基酸序列同源性建立系統(tǒng)發(fā)生樹(shù),從系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)上可以看出,A66株和其它I型DHV參考毒株大致可分為A和B兩個(gè)大的基因群,A基因群包括A66株及中國(guó)、美國(guó)、歐洲國(guó)家和韓國(guó)等30株I型DHV,B基因群包括1990年和2004年在中國(guó)臺(tái)灣分離的兩株變異參考毒株90D和04G株。A66弱毒株與C80弱毒株、JX強(qiáng)毒株在進(jìn)化上的關(guān)系最近,處在同一個(gè)小分支內(nèi)。 參照A66株的RNA聚合酶基因序列,設(shè)計(jì)了2對(duì)引物,建立了適合I型DHV的

5、快速檢測(cè)的逆轉(zhuǎn)錄套式PCR方法(RT-nested-PCR)。通過(guò)對(duì)I型鴨病毒性肝炎病毒弱毒株A66或強(qiáng)毒株R85952進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄套式PCR檢測(cè),結(jié)果均能擴(kuò)增到304 bp的條帶,而正常鴨胚、健康鴨肝、鴨瘟病毒、鵝細(xì)小病毒、禽流感病毒(H9亞型)、新城疫病毒、法氏囊病毒、減蛋綜合征病毒、鴨源大腸桿菌、鴨疫里氏桿菌和鴨源多殺性巴氏桿菌的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。該方法一次擴(kuò)增的敏感性是100 pg,二次擴(kuò)增的敏感性是1 fg,第二次擴(kuò)增的敏感性提