沙門氏菌逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測方法的研究.pdf

1、食品安全關(guān)系國計(jì)民生，影響著人們的生活、工作與健康，越來越引起人們的關(guān)注。其中食源性致病菌是引起人類食源性疾病的主要病因之一，而沙門氏菌又是其中最常見的食源性致病菌，所引發(fā)的疾病占世界食源性疾病的第一位，同樣也占我國內(nèi)陸地區(qū)食物中毒的第一位。對(duì)于沙門氏菌的檢測目前多以傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測方法及生化檢測為主，血清型檢測為輔，大多操作步驟繁瑣，周期較長，對(duì)細(xì)菌的某些亞種及亞型也不能給出理想的鑒定結(jié)果，在實(shí)際運(yùn)用中遇到越來越多的問題。近年來，分子生

2、物學(xué)的發(fā)展及其與病原性細(xì)菌檢測法相結(jié)合大大提高了檢測的效率，縮短了檢測流程，但這些方法多針對(duì)細(xì)菌的DNA水平，受死亡細(xì)菌殘留DNA、同源性核酸片段及“活的不可培養(yǎng)狀態(tài)微生物”的影響，無法區(qū)別死或活的細(xì)菌，常常造成PCR檢測結(jié)果與常規(guī)方法相比，陽性率偏高的現(xiàn)象。
　　 本研究采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，以細(xì)菌的RNA為檢測靶標(biāo)，利用RNA與細(xì)菌存活狀態(tài)及數(shù)量的相關(guān)性，建立了普通逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測方法和實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄PC

3、R檢測方法。同時(shí)，在樣品制備時(shí)采用新型的、具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的磁性納米粒子技術(shù)，用于沙門氏菌mRNA分離，提高mRNA制備的特異性，可有效提高檢測方法的靈敏度。其中，普通逆轉(zhuǎn)錄PCR方法針對(duì)沙門氏菌轉(zhuǎn)錄的起始因子rpoD基因設(shè)計(jì)引物Salmrpod2/5，以rpoD基因的mRNA為檢測對(duì)象，能有效地將沙門氏菌與其他親緣關(guān)系較近的腸桿菌科細(xì)菌區(qū)分開來。樣品中沙門氏菌添加實(shí)驗(yàn)表明，該方法對(duì)沙門氏菌的檢測下限＜100cfu/25ml(g)，檢測

4、時(shí)間少于18h。熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測方法，針對(duì)沙門氏菌外膜蛋白OmpC基因進(jìn)行檢測，使用Taqman探針，能有效地將沙門氏菌與其他親緣關(guān)系較近的腸桿菌科區(qū)分開來。該方法檢測靈敏度達(dá)到2個(gè)拷貝，檢測下限＜10cfu/25ml(g)，可在4小時(shí)內(nèi)得到檢測結(jié)果。同時(shí)，我們將此方法與市售的沙門氏菌屬熒光定量PCR檢測試劑盒相比較，發(fā)現(xiàn)該法具有更高的靈敏度。相比于普通逆轉(zhuǎn)錄PCR，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)更具有靈敏度高、特異性好、無需PCR反應(yīng)

5、后處理步驟等優(yōu)點(diǎn)。
　　 本研究所使用的磁性納米粒子分離mRNA法，大大地縮短了檢測時(shí)間，節(jié)省實(shí)驗(yàn)步驟，節(jié)約檢測成本。該方法在30min內(nèi)便可實(shí)現(xiàn)直接從細(xì)胞或組織中高效地提取mRNA，從目標(biāo)菌株中快速、有效地富集并提取mRNA與傳統(tǒng)的RNA提取方法相比，該法不需抽提總RNA，也不需要使用oligo(dT)纖維柱，同時(shí)避免了酚-氯仿抽提、乙醇沉淀、高速離心等步驟，該法解決了目前制約食品中致病菌檢測周期的前增菌時(shí)間過長問題，并且研究

6、過程中采用進(jìn)口磁珠試劑盒與本研究中使用的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的磁珠試劑盒比較，兩者mRNA分離效率一致。
　　 本研究利用添加陽性菌株模擬了沙門氏菌污染食品的實(shí)驗(yàn)，通過貯存時(shí)間和溫度的調(diào)節(jié)，測定菌株核酸的穩(wěn)定性及檢測效率。我們模擬了日常生活中食品的處理溫度，如100℃和80℃加熱1h后用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法進(jìn)行檢測或-20℃、4℃及室溫下放置貯存24h、48h、7d、14d后用普通RT-PCR法進(jìn)行檢測。當(dāng)沙門氏菌完全死亡時(shí)，實(shí)時(shí)