豬流行性腹瀉弱毒疫苗毒株的全基因組克隆及序列分析.pdf

1、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)是引起豬流行性腹瀉(PED)的病原，也是豬重要的腸道病原之一;本病以引起豬的急性水樣腹瀉、嘔吐和迅速脫水為主要特征，5日齡內(nèi)的仔豬感染后死亡率可達(dá)100％。因此，我國大部分豬場都會用疫苗來預(yù)防PED。但是，從2010年以來，PED突然在我國南方地區(qū)暴發(fā)并迅速傳播到全國各地，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而疫苗在這次的PED流行中并沒有給豬群應(yīng)有的保護(hù)。
　　 為了揭示豬場PED弱毒疫苗免疫失敗的

2、原因，本試驗從廣東、廣西和湖北的3個規(guī)?；i場得到了3株P(guān)ED弱毒活疫苗，首先對3株疫苗毒株進(jìn)行M基因的測序，結(jié)果顯示3株疫苗毒株有兩個疫苗毒株的序列完全一樣，另一個毒株有1個核苷酸的突變，說明3株疫苗毒株來源相同。我們選取其中一株疫苗毒株，進(jìn)行基因組全序列測定，并分析疫苗毒株與流行毒株的全序列、S、M、N、ORF3的核苷酸和氨基酸的序列差異，從基因水平上分析豬場免疫失敗的原因。
　　 遺傳進(jìn)化結(jié)果顯示，無論在全基因組水平還是在

3、各個基因水平，疫苗毒株與目前流行毒株的親緣關(guān)系都很遠(yuǎn)。在全基因組水平，疫苗毒株與目前流行毒株的同源性為97.1％～97.2％;在三個結(jié)構(gòu)基因S、M、N的水平上疫苗毒株與目前流行毒株的核苷酸（氨基酸）同源性分別為93.7％～95％（92％～93.4％）、97％～98.7％(97.3％～98.6％)、95.7％～97.3％(95.9％～97.5％)。由此可以看出疫苗毒株與流行毒株的核苷酸同源性很低，從一個方面說明弱毒疫苗不能很好的保護(hù)仔豬免

4、受流行毒株的感染。分析疫苗毒株和流行毒株的主要免疫原性基因發(fā)現(xiàn)，在S基因預(yù)測的受體結(jié)合位點和誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的關(guān)鍵區(qū)域，疫苗毒株和流行毒株都有氨基酸的突變，在M基因和N基因內(nèi)部，流行毒株相對于疫苗毒株也有很多氨基酸位點的突變，預(yù)測這些位點的突變可能造成了流行毒株毒力的增強(qiáng)或者造成PEDV抗原性發(fā)生變化，從而造成了PEDV弱毒疫苗對PED流行毒株免疫失敗。
　　 通過PEDVM基因和N基因的進(jìn)化樹、核苷酸和氨基酸的序列比較發(fā)現(xiàn)

5、，以中國2004年的毒株JS-2004-2為代表的PEDV毒株與近兩年流行的PEDV變異毒株在進(jìn)化關(guān)系和同源性方面都很接近，說明他們之間的親緣關(guān)系很近，由此可以推測PEDV的變異毒株可能很早就在我國的豬場存在。我國目前的流行的PED變異毒株很有可能就是由這些毒株進(jìn)化來的。推測在2010年之前，這些毒株可能只是在很小的區(qū)域存在，加上PEDV引起的臨床癥狀和病理變化與TGEV很相似，這些變異毒株被忽略了，隨著地區(qū)間豬場的交流增多，變異毒株在

6、全國傳播，才造成2010年以來的PED在我國暴發(fā)。
　　 感染性克隆是研究RNA病毒致病機(jī)理的理想工具，用于感染性克隆的病毒，最好是適應(yīng)細(xì)胞的病毒。本實驗以PEDV弱毒疫苗毒株為基礎(chǔ)，構(gòu)建了覆蓋PEDV基因組全長的重組質(zhì)粒，以及用于體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的5’端（含CMV啟動子）和3’端（含polyA+HDV核酶+BGH+polyadenylation序列）以及體外轉(zhuǎn)錄所需要的5’端（含T7啟動子）和3’端(含polyA)，為PEDV感染性克