家蠶解毒酶系的表達(dá)特性研究.pdf

1、家蠶的解毒酶系是一類異質(zhì)酶系，主要包括酯酶（主要是羧酸酯酶）和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、細(xì)胞色素P450和非專一性酯酶等，能夠代謝大量的內(nèi)源或外源底物。代謝抗性機(jī)制主要是通過(guò)解毒代謝酶基因擴(kuò)增或過(guò)量表達(dá)，導(dǎo)致解毒代謝調(diào)節(jié)酶的活性顯著升高，解毒代謝能力增強(qiáng)而形成抗性。因此家蠶解毒酶系的表達(dá)特性及相關(guān)基因的克隆與功能研究對(duì)闡明昆蟲抗性的分子機(jī)理具有十分重要的意義。
　　本研究?jī)?nèi)容包括以下四個(gè)方面:
　　(1)家蠶AChE

2、和GST相關(guān)基因的克隆與鑒定。本文對(duì)農(nóng)藥具有抗性及敏感性家蠶體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶(AChE)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)基因進(jìn)行了基因擴(kuò)增與克隆，根據(jù)AChE和GSTs基因翻譯的氨基酸序列用同源模建方法和從頭模建方法分析了抗性蠶品種與敏感性蠶品種蛋白氨基酸的突變對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示，抗性與敏感性蠶品種的AChE共有4個(gè)氨基酸差異，分別是抗性18位的異亮氨酸、486的天冬氨酸、553的賴氨酸、606的纈氨酸突變?yōu)槊舾械牡鞍彼?、?/p>

3、氨酸、谷氨酸和丙氨酸?？剐耘c敏感性蠶品種GSTs只有1個(gè)氨基酸差異，即抗性93位的纈氨酸突變?yōu)槊舾械谋彼?。氨基酸的差異?duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響，從而影響酶活性，使家蠶的抗性發(fā)生改變。
　　(2)家蠶乙酰膽堿酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析。本文研究了對(duì)農(nóng)藥具有抗性及敏感性家蠶體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶(AChE)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，農(nóng)藥抗性與敏感性家蠶脂肪體中AChE與GSTs基因

4、的相對(duì)表達(dá)量具有明顯差異。在脂肪組織中，農(nóng)藥抗性家蠶品種脂肪體AChE的相對(duì)表達(dá)量明顯高于敏感性蠶品種，尤其是在5齡中期（5齡第4天）以前?？剐约倚Q品種脂肪體中GSTs相對(duì)表達(dá)量隨著齡期的增加而顯著升高，而敏感性蠶品種則維持較低的相對(duì)表達(dá)量水平，到了5齡中期以后，兩者間的相對(duì)表達(dá)量差異更大。以上研究表明有機(jī)磷和氨基甲酸酯殺蟲劑農(nóng)藥進(jìn)入蠶體后，脂肪體中的AChE和GSTs都參與重要的解毒作用，脂肪體是家蠶重要的解毒器官。
　　(3)

5、乙酰膽堿酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性與家蠶對(duì)農(nóng)藥的抗性密切相關(guān)。本文測(cè)定了對(duì)農(nóng)藥具有抗性及敏感性家蠶體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性。結(jié)果顯示，農(nóng)藥抗性與敏感性家蠶中腸AChE活性具有明顯差異，同一時(shí)期比較，農(nóng)藥抗性家蠶中腸的AChE顯著高于敏感性家蠶;抗性家蠶品種血液中谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性隨著齡期的增加而顯著升高，而敏感性蠶品種則維持較低的活性水平，到了5齡第6天，兩者活性相差近5倍;抗性家蠶品種脂肪體谷胱甘肽-S-

6、轉(zhuǎn)移酶活性也明顯高于敏感性蠶品種。以上研究表明有機(jī)磷和氨基甲酸酯殺蟲劑農(nóng)藥進(jìn)入蠶體后，中腸組織中的AChE首先參與其解毒作用;當(dāng)農(nóng)藥進(jìn)入血液和脂肪體組織后GSTs作為重要的解毒酶參與作用。
　　(4)我們分別從杭州市河道污染較嚴(yán)重的錢塘河及備塘河取污水，浸漬桑葉后喂蠶，調(diào)查家蠶的慢性中毒癥狀、死亡率，眠蠶體重等，并測(cè)定了家蠶體內(nèi)乙酰膽堿酯酶及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性，評(píng)估家蠶作為農(nóng)業(yè)生境污染物殘留檢測(cè)的技術(shù)可行性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所