DCM脫鹵酶基因的克隆表達及特性的研究.pdf

1、二氯甲烷（Dichloromethane，簡稱DCM）作為重要的醫(yī)藥化工中間體和有機溶劑，被廣泛運用于工業(yè)生產(chǎn)中。一些未經(jīng)處理的DCM廢氣進入大氣和水體得到累積，嚴重危害到人類健康和生態(tài)環(huán)境。傳統(tǒng)微生物降解DCM的時間較長，過程極易染菌，不易控制。而本實驗通過構(gòu)建DCM脫鹵酶工程菌，經(jīng)誘導(dǎo)表達和提取純化獲得大量DCM脫鹵酶的純酶。由此，利用酶的高效性、專一性、作用條件溫和等特點，短時間迅速達到降解污染物的效果，作用條件易控。
　　

2、本研究以實驗室前期分離篩選到的1株以DCM為唯一碳源的DCM降解菌—Methylobacterium rhodesianum為供試菌株。以已在NCBI數(shù)據(jù)庫公布的Methylobacterium extorquens DM4的DCM脫鹵酶基因作為模板設(shè)計特異性引物，擴增得到M.rhodesianum的DCM脫鹵酶基因序列;將得到的DCM脫鹵酶基因序列提交至NCBI，得到序列登錄號(access no.KM243642)。利用生物信息學手

3、段將該序列與M.extorquens DM4的DCM脫鹵酶基因比對，結(jié)果顯示只有一個堿基的差別，即該序列在62bp處的G代替了M.extorquens DM4的DCM脫鹵酶基因的C。運用DNAMAN軟件分析核酸序列的分子量、堿基組成和堿基分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DCM脫鹵酶核酸序列的堿基組成是A217,C210，G265，T175;百分比為A25.0％，C24.2％，G30.6％，T20.2％;分子量(kDa): ssDNA為269.00，dsD

4、NA為534.55;氨基酸的個數(shù)為289;蛋白的pI為6.33。蛋白質(zhì)的親水和疏水性分析發(fā)現(xiàn)DCM脫鹵酶的疏水性較強，最大值達到2.2。DCM脫鹵酶的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示其主要以α-螺旋、不規(guī)則盤繞和延伸鏈為最大量的結(jié)構(gòu)元件，β-折疊散布于整個蛋白質(zhì)中。
　　將DCM脫鹵酶基因克隆至大腸桿菌中表達，提取純化而得到DCM脫鹵酶純酶，DCM脫鹵酶的分子量大小為33 kDa;對酶活性分析發(fā)現(xiàn)重組E.coli BL21(DE3)中DCM脫鹵酶

5、酶活是出發(fā)菌株M.Rhodesianum的3倍，細胞內(nèi)外酶活的對比實驗表明DCM脫鹵酶是胞內(nèi)表達。它的最適作用溫度是40℃，最適pH是7-8，該酶的Km為10.96mM。DCM脫鹵酶降解DCM的代謝機理被許多科學家假設(shè)過，推測DCM在DCM脫鹵酶的作用下產(chǎn)生HCl和甲醛。然而，這個假設(shè)只是經(jīng)過菌體粗酶液初步的推測，目前尚未通過DCM脫鹵酶純酶降解DCM實驗得到驗證。本課題將純化的DCM脫鹵酶用于驗證該過程，實驗數(shù)據(jù)顯示DCM脫鹵酶降解D