表達(dá)人源化糖蛋白的家蠶BmN細(xì)胞系的建立.pdf

1、自上世紀(jì)80年代桿狀病毒介導(dǎo)的外源基因表達(dá)首次報(bào)道以來，已有近千種外源蛋白在該系統(tǒng)中得以成功表達(dá)。由于其效率高、周期短、成本低等優(yōu)點(diǎn)，如今昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)已發(fā)展為四大表達(dá)系統(tǒng)(原核表達(dá)系統(tǒng)，酵母表達(dá)系統(tǒng)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng))之一。但是隨著認(rèn)識(shí)地深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)也存在著一些重大缺點(diǎn)，主要表現(xiàn)在昆蟲/昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)往往呈現(xiàn)不具備唾液酸化的復(fù)雜的蛋白質(zhì)糖鏈。然而，糖鏈在糖蛋白發(fā)揮功能的過程中往往扮演著重要作用，如末端唾

2、液酸化的蛋白質(zhì)在血液中的半衰期明顯比無唾液酸化得蛋白質(zhì)長(zhǎng)。已有研究表明，昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)不能產(chǎn)生復(fù)雜糖鏈的糖蛋白這主要?dú)w結(jié)于昆蟲細(xì)胞內(nèi)缺少哺乳動(dòng)物細(xì)胞糖基化修飾過程中一些必要的糖基轉(zhuǎn)移酶。另一方面，昆蟲細(xì)胞內(nèi)特異性的N-乙酰氨基葡萄糖苷(N-acetylglucosaminidase，GlcNAcase)能夠特異性地將糖蛋白末端的N-乙酰氨基葡萄糖殘基切除，從而阻止N-糖鏈進(jìn)一步延長(zhǎng)。
　　 本研究通過克隆得到哺乳動(dòng)物細(xì)胞

3、中糖基化所必須的基因N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶Ⅱ，beta-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ，alpha-2，6-及alpha-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，并利用piggyBac轉(zhuǎn)座子將它們及GFP基因和Neor基因共同轉(zhuǎn)座至家蠶BmN細(xì)胞系的基因組中，通過G418篩選得到了一株抗G418的、發(fā)綠色熒光的轉(zhuǎn)基因BmN細(xì)胞系。基因組PCR、RT-PCR及splinkerette-PCR表明所得的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中含有并且能表達(dá)上述四個(gè)基因。
　　 另外

4、，我們利用RNAi(RNA interference)技術(shù)來阻斷GlcNAcase的功能。通過將合成的dsGlcNAcase直接加入正常BmN細(xì)胞培養(yǎng)物中，再利用real-time PCR來檢測(cè)GlcNAcase的表達(dá).結(jié)果表明80 nM的dsGlcNAcase即可干擾約82％的GlcNAcase的合成。
　　 本文首次嘗試通過向家蠶細(xì)胞中導(dǎo)入來自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的糖基轉(zhuǎn)移酶，并干擾抑制家蠶細(xì)胞內(nèi)特異性的加工酶GlcNAcase，以