家蠶和野桑蠶解毒酶活性的比較及野桑蠶CYP9A20V1基因的克隆與表達.pdf

1、昆蟲體內(nèi)有三大解毒酶系，分別為谷胱甘肽S-轉移酶、酯酶、細胞色素P450氧化酶，它們的功能主要是分解外源有毒有害物質(zhì)，或通過與有毒有害物質(zhì)相結合，使得這些有毒物質(zhì)無法到達作用靶標。野桑蠶和家蠶同屬鱗翅目蠶蛾科，由共同祖先進化來的，家蠶長期在室內(nèi)人工飼養(yǎng)，而野桑蠶經(jīng)過自然選擇，其種群和家蠶品種之間在抗性、遺傳背景等方面都存在一定的差異。 為了了解家蠶和野桑蠶之間的三大解毒酶差異水平，采用酶活性動力學法測定家蠶和野桑蠶5齡第3天幼蟲

2、不同組織的解毒酶活性。谷胱甘肽-S-轉移酶在脂肪體組織中的活性要高于中腸；家蠶脂肪體的GST活性為177.2±5.66nmol/min/mgprotein，野桑蠶的脂肪體GST活性為296±26.85nmol/min/mgprotein，是家蠶的1.67倍，差異顯著；而家蠶和野桑蠶中腸組織的GST活性差異不大。酯酶活性在組織中以中腸活性最高，可以得知酯酶的水解作用主要發(fā)生在中腸中；家蠶中腸的酯酶活性為235.8±3.28nmol/min

3、/mgprotein，野桑蠶中腸的酯酶活性為467.7±10.2nmol/min/mgprotein，是家蠶的1.98倍，差異顯著；而家蠶和野桑蠶脂肪體組織的活性較低。野桑蠶的細胞色素P450氧化酶脂肪體活性高于中腸，而在家蠶中腸和脂肪體中很難檢測到活性。野桑蠶的三大解毒酶活性都要高于家蠶，與野桑蠶殺蟲劑抗性高于家蠶相一致。 昆蟲解毒酶介導的抗藥性主要有兩種，一種是基因功能的改變，另一種是基因的超量轉錄，導致了抗性的進化。有研究

4、結果表明，一些昆蟲對殺蟲劑抗性的增加是由于細胞色素P450氧化酶的改變造成的。比較和研究家蠶與野桑蠶細胞色素P450基因的結構和功能，可從分子生化機制上研究家蠶對農(nóng)藥的抗性。 基于此，利用RT-PCR方法從野桑蠶中腸組織中克隆了一個P450家族基因CYP9A20V1(GenBank登錄號：FJ378716)。序列分析表明，該基因的開放閱讀框(ORF)為1596bp，編碼531個氨基酸，預測分子質(zhì)量約61.4kD，等電點8.1。在

5、線Blast分析結果表明：野桑蠶CYP9A20V1與家蠶CYP9A20的同源關系最近，同源性達到98.7％；與棉鈴蟲CYP9A12的同源性也達到57.1％。根據(jù)已知的P450蛋白序列結構進行比較分析，野桑蠶CYP9A20V1與家蠶CYP9A20氨基酸序列在底物識別位點SRS1、SRS2、SRS4、SRS6區(qū)域完全相同，在SRS3和SRS5區(qū)域的同源性分別是88.9％和94.1％，推測這2個基因具有相同的底物識別能力；野桑蠶CYP9A20

6、V1與棉鈴蟲CYP9A12在SRS1、SRS4、SRS5、SRS6區(qū)域的同源性分別為47.1％、88.2％、76.5％和60％，在底物識別區(qū)域的同源性較高。初步推測野桑蠶CYP9A20V1基因可能與抗除蟲菊酯類農(nóng)藥有關。 為了研究野桑蠶CYP9A20V1蛋白功能，我們利用Bac-to-Bac系統(tǒng)進行真核表達，并對其產(chǎn)物檢測生物活性。構建一個Bac-CYP9A20V1重組病毒，用脂質(zhì)體法轉染Sf9細胞，獲得表達產(chǎn)物。SDS-PAG

7、E和Westernblotting分析顯示，感染重組桿狀病毒Bac-CYP9A20V1的細胞表達產(chǎn)物在約為64kD處出現(xiàn)特異性條帶，與推導的蛋白大小相符。該表達產(chǎn)物以PNA為底物測定酶活力，正常Sf9細胞和感染Bacmid的Sf9細胞均未檢測出PNOD活性，而感染Bac-CYP9A20V1細胞的活性為0.692±0.075nmol/min/mgprotein，體外真核細胞表達CYP9A20V1蛋白有著較強的O-脫甲基活性，表達成功，為下