水通道蛋白7介導(dǎo)的卵泡刺激素對脂肪細(xì)胞成脂作用機(jī)制研究.pdf

1、脂肪分解、合成和轉(zhuǎn)運(yùn)等各個(gè)通路的失調(diào)均可導(dǎo)致肥胖。水甘油通道蛋白7是脂肪細(xì)胞最主要的甘油通道，與肥胖發(fā)生相關(guān)。AQP7缺失時(shí)，一方面，脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油無法排出，造成饑餓狀態(tài)下肝臟糖異生原料的來源不足，出現(xiàn)空腹低血糖;另一方面，脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油濃度持續(xù)增加，激活原本微弱的甘油激酶，促使3-磷酸甘油的生成增多，細(xì)胞內(nèi)TG合成增強(qiáng)，脂肪積累，導(dǎo)致細(xì)胞肥大、肥胖發(fā)生。AQP7敲除小鼠出現(xiàn)代謝紊亂和肥胖。對人類的研究也顯示AQP7基因多態(tài)性、表達(dá)下降

2、與肥胖密切相關(guān)。Nature雜志曾評論AQP7是肥胖研究的另一切入點(diǎn)，有望成為肥胖的治療新靶點(diǎn)。例如，在絕經(jīng)后肥胖這一現(xiàn)象中，絕經(jīng)后女性的內(nèi)臟脂肪細(xì)胞體積增大，處于脂肪分解和合成均增強(qiáng)的狀態(tài)，這與AQP7功能丟失所致肥胖的脂肪代謝狀態(tài)非常相似。因此，我們不禁要問，AQP7是否在絕經(jīng)后的脂肪細(xì)胞成脂異常中發(fā)揮了一定作用呢？
　　為了回答這一問題，需要從絕經(jīng)后脂肪細(xì)胞成脂改變的機(jī)制談起。絕經(jīng)后肥胖的發(fā)生被公認(rèn)為與女性體內(nèi)性激素水平劇變

3、密切相關(guān)。此期女性內(nèi)分泌紊亂主要表現(xiàn)為急劇下降的血清雌二醇(E2)水平及顯著升高的卵泡刺激素(FSH)水平。雖然目前E2水平降低與肥胖發(fā)生之間關(guān)系研究較為透徹，但近期研究提示血清高FSH與絕經(jīng)后肥胖發(fā)生直接相關(guān)。這促使我們重新思索，在排除E2作用的前提下，F(xiàn)SH能否直接參與成熟脂肪細(xì)胞成脂作用？AQP7是否介導(dǎo)著這一過程？機(jī)制如何？
　　本研究以絕經(jīng)前后女性脂肪組織AQP7表達(dá)量的比較為切入點(diǎn)，在前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)哺乳動物脂肪組織表達(dá)卵

4、泡刺激素受體的基礎(chǔ)上，結(jié)合在體動物模型和體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，探討AQP7是否介導(dǎo)了卵泡刺激素對脂肪細(xì)胞的成脂作用。同時(shí)通過分子生物學(xué)技術(shù)手段探索卵泡刺激素對AQP7調(diào)控的分子機(jī)制。這不僅能推動水通道蛋白與肥胖領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究、補(bǔ)充性激素調(diào)控水通道蛋白的理論知識，其作用機(jī)制的闡明也將為絕經(jīng)相關(guān)肥胖的防治提供潛在靶點(diǎn)。
　　絕經(jīng)后與育齡期女性脂肪組織AQP7表達(dá)量的差異
　　目的:比較絕經(jīng)后與育齡期女性內(nèi)臟脂肪組織、皮下脂肪組織AQ

5、P7表達(dá)量的差異。
　　方法:收集5例育齡期女性、13例絕經(jīng)后女性的內(nèi)臟和皮下脂肪標(biāo)本，比較其內(nèi)臟脂肪組織和皮下脂肪組織AQP7蛋白表達(dá)的差異，并分析AQP7表達(dá)量與女性基礎(chǔ)血FSH水平的相關(guān)性。
　　結(jié)果:1.與育齡期女性相比，絕經(jīng)后女性的內(nèi)臟脂肪和皮下脂肪中的AQP7蛋白表達(dá)量均顯著下調(diào);2.無論是育齡期女性或是絕經(jīng)后女性，相同個(gè)體的內(nèi)臟脂肪組織的AQP7含量均顯著高于皮下脂肪組織;3.基礎(chǔ)血FSH與皮下脂肪組織AQP7

6、表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)，與內(nèi)臟脂肪組織AQP7表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論:絕經(jīng)后女性脂肪組織AQP7的表達(dá)明顯下降，這與其基礎(chǔ)血FSH升高密切相關(guān);對相同個(gè)體來說，內(nèi)臟脂肪組織中的AQP7含量更高，說明AQP7可能在內(nèi)臟脂肪組織中發(fā)揮更重要的作用。
　　FSH調(diào)節(jié)成熟脂肪細(xì)胞AQP7表達(dá)和功能
　　目的:探討FSH是否直接參與了成熟脂肪細(xì)胞中AQP7的表達(dá)與甘油轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。
　　方法:采用C57/BL6雌、雄性小

7、鼠，分別建立假手術(shù)組（SHAM）、手術(shù)去勢(OVX/ORX)、藥物去勢+手術(shù)去勢(OVX/ORX+GnRHa)、藥物去勢+手術(shù)去勢+外源性FSH（OVX/ORX+GnRHa+FSH）四組在體動物模型，測定各組小鼠的血清FSH、LH、E2/睪酮水平，比較組間同性小鼠的體重、脂肪組織AQP7表達(dá)以及甘油轉(zhuǎn)運(yùn)功能的差異。體外培養(yǎng)小鼠3T3-L1前體脂肪細(xì)胞系和分離的人原代脂肪前體細(xì)胞，予經(jīng)典的雞尾酒方法誘導(dǎo)分化至成熟脂肪細(xì)胞，予不同濃度的FS

8、H處理，觀察FSH對成熟脂肪細(xì)胞的AQP7表達(dá)和成熟脂肪細(xì)胞成脂影響，并用SiRNA特異性敲除FSHR，探討FSH是否通過其受體發(fā)揮作用。
　　結(jié)果:1.OVX/ORX組血清FSH水平較相應(yīng)對照SHAM組顯著升高，血清E2/睪酮水平顯著降低，符合絕經(jīng)后高FSH狀態(tài)，模型構(gòu)建成功;OVX/ORX+GnRHa+FSH較OVX/ORX+GnRHa組僅僅血清FSH顯著升高，E2/睪酮和LH水平均無顯著差異;2.與OVX/ORX+GnRHa

9、組相比，OVX/ORX+GnRHa+FSH組小鼠表現(xiàn)出成熟脂肪組織AQP7表達(dá)量的下降、成熟脂肪細(xì)胞甘油轉(zhuǎn)運(yùn)功能的下降以及體重、脂肪體重比的上升;3.在體外培養(yǎng)的3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞中，F(xiàn)SH能夠濃度依賴性地下調(diào)成熟脂肪細(xì)胞中AQP7的表達(dá)，當(dāng)通過SiRNA敲減FSHR之后，F(xiàn)SH對AQP7的作用將被完全抑制;4.在小鼠3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞和人原代成熟脂肪細(xì)胞中，F(xiàn)SH能夠濃度依賴性地上調(diào)成熟脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)積累，并上調(diào)入原代成熟

10、脂肪細(xì)胞的瘦素分泌、下調(diào)脂聯(lián)素分泌。
　　結(jié)論:在成熟脂肪細(xì)胞中，F(xiàn)SH通過其受體FSHR直接下調(diào)AQP7的表達(dá)和甘油轉(zhuǎn)運(yùn)功能，從而促進(jìn)脂質(zhì)積累。
　　FSH-FSHR調(diào)控AQP7表達(dá)的作用機(jī)制
　　目的:課題組前期研究提示，在脂肪前體細(xì)胞的誘導(dǎo)分化過程中，F(xiàn)SH-FSHR能夠通過促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，激活CREB而對脂質(zhì)代謝發(fā)生作用。檢索文獻(xiàn)后我們發(fā)現(xiàn)，CREB能夠競爭性地結(jié)合AP-1的作用位點(diǎn)來抑制AP-1的轉(zhuǎn)錄因子功

11、能。這一部分旨在探討FSH-FSHR是否能通過抑制AP-1與AQP7啟動子區(qū)AP-1反應(yīng)元件（AP1-RE）的結(jié)合而下調(diào)AQP7在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)。
　　方法:構(gòu)建AQP7啟動子區(qū)兩段序列的重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到分化成熟的3T3-L1細(xì)胞，預(yù)先用羅格列酮或腎上腺素兩種經(jīng)典藥物上調(diào)重組AQP7 promoter質(zhì)粒的熒光素酶活性，再以高濃度FSH處理細(xì)胞，裂解細(xì)胞后檢測熒光素酶活性檢測是否受到抑制;利用染色質(zhì)免疫共沉淀、熒光實(shí)時(shí)定量

12、PCR等技術(shù)鑒定AP1-RE在AQP7啟動子區(qū)的定位以及高FSH對AQP7啟動子區(qū)與AP-1結(jié)合的影響。
　　結(jié)果:1.在羅格列酮上調(diào)重組質(zhì)粒AQP7 promoter S2-pGL3的熒光素酶活性之后，F(xiàn)SH能夠明顯抑制其熒光素酶活性。這說明FSH能通過抑制AQP7啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性來下調(diào)AQP7的表達(dá)，且作用位點(diǎn)在啟動子區(qū)的S2片段上。2.小鼠AQP7基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-992至986處存在AP1-RE，在小鼠成熟脂肪細(xì)胞中