低氧環(huán)境下蛋白酶體β5亞單位（PSMB5）過表達(dá)對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、白內(nèi)障是全球最主要的致盲性眼病。雖然白內(nèi)障超聲乳化吸除術(shù)聯(lián)合人工晶體植入術(shù)是目前治療白內(nèi)障最理想的方法，但是手術(shù)需要大量的人力物力，而且術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生以及人工晶體缺乏調(diào)節(jié)等不足之處都嚴(yán)重影響了病人的生存質(zhì)量。因此，尋求預(yù)防和延緩白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展的方法一直是眼科研究領(lǐng)域內(nèi)的重點(diǎn)之一。晶狀體在老化的過程中受到各種因素的影響，如氧化、紫外線照射等。而氧化因素能引起晶狀體上皮細(xì)胞凋亡、晶狀體蛋白變性、交聯(lián)，失去正常功能，因此被認(rèn)為是導(dǎo)致年齡相關(guān)

2、性白內(nèi)障形成的重要因素。蛋白酶體系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白降解的主要途徑之一，參與大多數(shù)短壽命蛋白以及變性蛋白的降解。晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)存在著完整的蛋白酶體系統(tǒng)，因此我們推測(cè)蛋白酶體在保護(hù)晶狀體免受氧化損傷方面發(fā)揮重要作用。 一、年齡相關(guān)性白內(nèi)障與透明晶體上皮內(nèi)蛋白酶體活性的比較 目的：比較老年性白內(nèi)障晶體上皮與透明晶體上皮內(nèi)蛋白酶體的糜蛋白酶樣(chymotrypsin-like)、胰蛋白酶樣(trysin-like)酶活性是否存

3、在差異，進(jìn)而探討蛋白酶體在老年性白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。 方法：白內(nèi)障晶體囊膜取自來我院行白內(nèi)障超聲乳化及人工晶體植入的患者，透明晶體囊膜取自廣東省眼庫(kù)，年齡與白內(nèi)障病人相匹配。 結(jié)果：透明晶體上皮的蛋白酶體活性明顯高于白內(nèi)障組(P＜0.01)；皮質(zhì)型與非皮質(zhì)型白內(nèi)障晶體上皮的糜蛋白酶樣酶活性無明顯區(qū)別(P＞0.05)；MG-132明顯抑制各組蛋白酶體的活性。 結(jié)論：與透明晶體相比，白內(nèi)障晶狀體上皮內(nèi)蛋白酶體

4、的糜蛋白酶樣、胰蛋白酶樣酶活性明顯降低，蛋白酶體活性降低可能在老年性白內(nèi)障的形成中起重要的調(diào)節(jié)作用。 二、真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/PSMB5質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定 目的：構(gòu)建蛋白酶體β5(PSMB5)基因真核表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)而探討蛋白酶體在年齡相關(guān)性白內(nèi)障的形成發(fā)展中所起的作用。 方法：從人晶狀體上皮細(xì)胞株SRAO1/04中提取總RNA，RT-PCR擴(kuò)增獲得PSMB5的全長(zhǎng)cDNA片段，克隆至真核表達(dá)載體pcDN

5、A3.1上，并進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序分析。結(jié)果：RT-PCR法擴(kuò)增出約800bp的PSMB5基因全部編碼序列的片段。酶切鑒定和測(cè)序分析證實(shí)所插入的PSMB5的基因序列完全正確。 結(jié)論：成功的構(gòu)建了蛋白酶體β5亞單位(PSMB5)基因真核表達(dá)重組質(zhì)粒，為PSMB5在白內(nèi)障形成中的作用提供基礎(chǔ)。 三、pcDNA3.1-PSMB5轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞及表達(dá) 目的：將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-PSMB5轉(zhuǎn)染人晶狀體上皮細(xì)胞并檢測(cè)其表

6、達(dá)，為進(jìn)一步研究蛋白酶體在年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制所起的作用打基礎(chǔ)。 方法：取細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合至60-70％，將2μg純化的質(zhì)粒DNA溶于100μl無血清的DMEM，加入10μl轉(zhuǎn)染試劑混勻，，室溫下孵育。吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，，將轉(zhuǎn)染混合液加入600μlDMEM培養(yǎng)液(含血清及抗生素)并混勻。37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)3小時(shí)，棄去轉(zhuǎn)染液，加入2ml含15％血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)

7、48小時(shí)后傳代，并加入G418(終濃度700μg/ml)篩選。5天后當(dāng)對(duì)照細(xì)胞大部分死亡時(shí)，更換一次篩選液，G418濃度降至300μg/ml。3周后挑取細(xì)胞克隆，重復(fù)上述篩選過程一次。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)提取總RNA檢測(cè)PSMB5基因mRNA的表達(dá)情況，提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆的蛋白，western檢測(cè)PSMB5蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：利用QIAGENSuperfect轉(zhuǎn)染試劑將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-PSMB5和空質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)入人晶狀

8、體上皮細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，14天后可見抗性細(xì)胞克隆出現(xiàn)，證明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功并有G418抗性基因表達(dá)。培養(yǎng)48小時(shí)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞吸去培養(yǎng)液后，用冰預(yù)冷的PBS洗三次，加入1mlTrizol，氯仿、異丙醇提取RNA，測(cè)定濃度。經(jīng)RT-PCR后取3μl擴(kuò)增產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠圖像分析儀處理。β-actin作為內(nèi)參。凝膠電泳結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PSMB5的人晶狀體上皮細(xì)胞組PSMB5基因的mRNA表達(dá)明顯高于其他組。Weste

9、rn檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1組在22KD(PSMB5)處有少量顯色條帶，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PSMB5組在22KD處出現(xiàn)較強(qiáng)的顯色帶。結(jié)論：本研究首次將重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1-PSMB5轉(zhuǎn)染人晶狀體上皮細(xì)胞株SRA01/04。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后PSMB5基因的mRNA表達(dá)顯著增加，western檢測(cè)單克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞，PSMB5蛋白表達(dá)明顯增加，表明重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人晶狀體上皮細(xì)胞成功。 四、低氧環(huán)境下

10、蛋白酶體β5亞單位過表達(dá)對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制 目的：觀察低氧環(huán)境下蛋白酶體β5亞單位對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞的保護(hù)作用，從而探討蛋白酶體在年齡相關(guān)性白內(nèi)障形成中所發(fā)揮的作用。 方法：細(xì)胞用不含酚紅和血清的DMEM-H2O2處理。細(xì)胞生存能力用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測(cè)定；Hoechst33342染色觀察細(xì)胞核形態(tài)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率；測(cè)定糜蛋白酶樣活性以及細(xì)胞內(nèi)羰基化蛋白含量。 結(jié)果：①不同濃度H2O2處

11、理細(xì)胞后，結(jié)果表明H2O2對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性。H2O2處理的PSMB5轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組之間存在著顯著性差異，未轉(zhuǎn)染組更明顯受到抑制。 ②Hoechst33342染色結(jié)果顯示，20μMH2O2處理的PSMB5轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組無顯著性差異。然而，60μMH2O2處理后，與PSMB5轉(zhuǎn)染組相比，未轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞核明顯收縮、濃縮。這表明PSMB5對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。 ③各組細(xì)胞用20μM及60μMH

12、2O2處理24小時(shí)。20μMH2O2處理24小時(shí)后，PSMB5轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組無顯著性差異，表明各組細(xì)胞能夠耐受此濃度的H2O2。而60μMH2O2處理24小時(shí)后，PSMB5轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡的比率顯著增高，但是未轉(zhuǎn)染組的凋亡率增加的更為顯著。 ④與未轉(zhuǎn)染PSMB5的細(xì)胞相比，PSMB5轉(zhuǎn)染細(xì)胞的蛋白酶體糜蛋白酶樣酶活性增高，表明轉(zhuǎn)染的PSMB5基因在細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)。各組樣本經(jīng)20μM及60μMH2O2處理4小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)2

13、0S蛋白酶體糜蛋白酶樣酶活性無顯著性差異。而各組樣本經(jīng)20μM及60μMH2O2處理24小時(shí)后，蛋白酶體糜蛋白酶樣酶活性均受到抑制，但是未轉(zhuǎn)染細(xì)胞比PSMB5轉(zhuǎn)染細(xì)胞受到更明顯的抑制，糜蛋白酶樣酶活性降低更顯著。 ⑤在正常培養(yǎng)條件下，細(xì)胞內(nèi)就有羰基化蛋白存在，但是含量很低。當(dāng)細(xì)胞處于60μMH2O2的低氧化壓力的環(huán)境下，細(xì)胞內(nèi)羰基化蛋白的含量卻明顯增加。與PSMB5轉(zhuǎn)染組相比，未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)羰基化蛋白的含量顯著增加，統(tǒng)計(jì)學(xué)具有顯