抑制FGF信號(hào)通路對(duì)橢圓囊毛細(xì)胞再生的調(diào)控研究.pdf

1、目的：慶大霉素等氨基糖苷類藥物對(duì)內(nèi)耳的毒性作用可通過破壞毛細(xì)胞而引起的聽力和平衡功能受損表現(xiàn)出來。但慶大霉素對(duì)橢圓囊感覺上皮的破壞程度和抑制FGF信號(hào)通路對(duì)過表達(dá)Atoh1/Math1基因引起毛細(xì)胞再生的調(diào)控作用仍有待詳細(xì)論述。本研究擬解決問題:1.利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)慶大霉素處理小鼠橢圓囊不同時(shí)間段引起的微紋區(qū)和非微紋區(qū)毛細(xì)胞損傷程度和細(xì)胞增殖程度進(jìn)行研究;2.抑制FGF信號(hào)通路對(duì)Ad-Math1誘導(dǎo)小鼠橢圓囊感覺上皮區(qū)域與非感覺上皮區(qū)域

2、內(nèi)細(xì)胞增殖和毛細(xì)胞樣細(xì)胞產(chǎn)生的調(diào)控作用;3.Ad-Math1誘導(dǎo)產(chǎn)生的新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞是否具有細(xì)胞平面極性及其調(diào)控機(jī)制研究。
　　方法：本研究使用慶大霉素建立體外培養(yǎng)橢圓囊毛細(xì)胞的損傷模型。于不同時(shí)間段觀察慶大霉素對(duì)橢圓囊微紋區(qū)和非微紋區(qū)內(nèi)Phalloidin標(biāo)記的毛細(xì)胞纖毛和毛細(xì)胞特異性抗體MyosinⅦa陽性細(xì)胞的破壞程度;以及通過增殖細(xì)胞EdU特異性染色觀察感覺上皮和非感覺上皮的細(xì)胞增殖情況。之后，利用激光共聚焦和SPSS軟

3、件從形態(tài)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)角度驗(yàn)證和分析慶大霉素對(duì)毛細(xì)胞的破壞和細(xì)胞增殖的作用。通過含有Atoh1/Math1基因的腺病毒載體(Ad-Math1)轉(zhuǎn)染小鼠體外培養(yǎng)橢圓囊組織以促進(jìn)毛細(xì)胞樣細(xì)胞產(chǎn)生。對(duì)轉(zhuǎn)病毒后不同時(shí)間點(diǎn)標(biāo)本進(jìn)行固定和免疫組織化學(xué)染色，驗(yàn)證過表達(dá)Atoh1/Math1基因?qū)Ω杏X上皮和非感覺上皮細(xì)胞增殖情況、新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞產(chǎn)生數(shù)量和規(guī)律的影響。與此同時(shí)，F(xiàn)GF信號(hào)通路阻滯劑與加入Ad-Math1和/或慶大霉素的橢圓囊組織共培養(yǎng)，觀察

4、其對(duì)新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞的調(diào)控作用。最后應(yīng)用觀察細(xì)胞平面極性的抗體Spectrin、γ-tubulin對(duì)Ad-Math1轉(zhuǎn)染的橢圓囊標(biāo)本進(jìn)行免疫熒光染色，觀察新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞的細(xì)胞平面極性規(guī)律。
　　結(jié)果：通過免疫熒光染色的形態(tài)學(xué)和SPSS的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法研究表明，體外培養(yǎng)新生小鼠前庭橢圓囊在慶大霉素處理后最早出現(xiàn)毛細(xì)胞纖毛損傷，以微紋區(qū)較明顯;毛細(xì)胞特異性標(biāo)記物MyosinⅦa陽性的細(xì)胞隨著時(shí)間的延長逐漸減少;標(biāo)記毛細(xì)胞前體細(xì)胞的Sox

5、2陽性細(xì)胞在微紋區(qū)中隨著時(shí)間的延長逐漸增多。同時(shí)，橢圓囊感覺上皮區(qū)域在慶大霉素處理后增殖細(xì)胞較對(duì)照組明顯增多，但隨著用藥劑量的增加，增殖細(xì)胞逐漸減少。Ad-Math1和慶大霉素共同作用橢圓囊組織后，感覺上皮區(qū)域細(xì)胞增殖較單純加入慶大霉素或Ad-Math1組多，且主要位于微紋區(qū)。當(dāng)同時(shí)加入FGF阻滯劑SU5402時(shí)，增殖細(xì)胞無明顯增多，但感覺區(qū)域與非感覺區(qū)域毛細(xì)胞特異性標(biāo)記物MyosinⅦa陽性細(xì)胞，即新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞較單純加入Ad-Ma

6、th1組增多。新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞動(dòng)纖毛從細(xì)胞表面中央逐漸移向一側(cè)，且標(biāo)記毛細(xì)胞纖毛極性的特異性標(biāo)記物Spectrin和γ-tubulin染色顯示感覺上皮區(qū)域新生的毛細(xì)胞樣細(xì)胞與原位存在的毛細(xì)胞平面極性方向一致，即纖毛延極性分界線相對(duì)排列。而非感覺上皮區(qū)域新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞極性紊亂。
　　結(jié)論：慶大霉素處理體外培養(yǎng)小鼠橢圓囊可導(dǎo)致毛細(xì)胞的損傷，并伴有感覺上皮和非感覺上皮細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。當(dāng)過量表達(dá)Atoh1/Math1基因可促使橢圓囊感