bFGF調(diào)控TLR4-NFκB信號通路抑制星形膠質(zhì)細胞過度活化的機制研究.pdf

1、目的:
　　星形膠質(zhì)細胞在中風、腦損傷、脊髓損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起到了關鍵作用，但過度活化的星形膠質(zhì)細胞為損傷部位形成了炎性環(huán)境，并促進神經(jīng)元死亡，不利于疾病恢復。bFGF作為重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，已被廣泛研究并被認為對神經(jīng)細胞有顯著的保護作用，但bFGF對于星形膠質(zhì)細胞活化過程的作用機制并不清楚，尤其是與神經(jīng)系統(tǒng)疾病炎癥相關的后期激活與過度活化調(diào)控機制尚未被探討。在我們的研究中，通過LPS誘導星形膠質(zhì)細胞建立體外活化模型，分析

2、星形膠質(zhì)細胞激活過程中內(nèi)源性bFGF水平變化，以及主要的活化相關蛋白表達情況;觀察不同濃度外源性bFGF對于原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞活化的影響，以及外源性bFGF對LPS誘導的星形膠質(zhì)細胞過度活化的抑制作用，探討bFGF抑制LPS引起的星形膠質(zhì)細胞過度活化的作用機制。
　　方法:
　　1.分別用2μg/mL的LPS作用于原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞6h，12h，24h，36h，Western Blot法檢測不同時間LPS對細胞內(nèi)源性

3、bFGF的表達的影響，ELISA檢測不同時間點內(nèi)源性bFGF釋放情況。
　　2.利用不同濃度的外源性bFGF(5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL,50ng/mL,100ng/mL，200ng/mL)作用于星形膠質(zhì)細胞24h，免疫熒光檢測GFAP表達及細胞的形態(tài)變化。
　　3.用2μg/mL的LPS作用于星形膠質(zhì)細胞24h，同時分別給與不同濃度的bFGF(25ng/mL，50ng/mL，100ng/mL)處理。Wes

4、tern Blot法檢測GFAP蛋白和膠質(zhì)細胞活化的相關蛋白（Vimentin、Nestin和Neurocan）表達情況，免疫熒光檢測GFAP表達及細胞形態(tài)變化。
　　4.用2μg/mL的LPS作用星形膠質(zhì)細胞24h，建立膠質(zhì)細胞過度活化模型，同時用100ng/mL bFGF作用24h。Western Blot法及檢測與炎癥相關的TLR4，IκBα，p-NFκBp65，IL-6，TNF-α的表達情況，免疫熒光檢測TLR4，MD2，

5、IκBα，NFκBp65表達，ELISA分析促炎癥因子IL-6，TNF-α釋放情況。
　　結(jié)果:
　　1.Western Blot實驗結(jié)果顯示LPS持續(xù)作用12h，24h，36h，內(nèi)源性bFGF蛋白表達明顯升高。ELISA結(jié)果顯示原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞釋放bFGF呈時間依賴性，在6-12h之間速率最快。
　　2.免疫熒光檢測結(jié)果表明，2μg/mL的LPS刺激時，星形膠質(zhì)細胞明顯活化，低濃度(5ng/mL，10ng/mL

6、，20ng/mL，50ng/mL) bFGF處理后，細胞活化較明顯，而高濃度(100ng/mL，200ng/mL) bFGF作用下，細胞活化情況受到一定程度的抑制。
　　3.Western Blot實驗結(jié)果顯示用100ng/mL的bFGF處理后，GFAP的表達明顯低于LPS單獨作用組。免疫熒光染色結(jié)果與Western Blot結(jié)果一致，并顯示細胞形態(tài)得到了改善，趨近于未活化形態(tài)。
　　4.Western Blot實驗結(jié)果顯示

7、100ng/ml的bFGF處理后，膠質(zhì)細胞活化相關的Vimentin，Neurocan蛋白在細胞中表達下降，而Nestin表達情況無明顯變化。
　　5.ELISA結(jié)果顯示用LPS誘導過的星形膠質(zhì)細胞，bFGF給藥處理后，促炎癥因子IL-6，TNF-α表達降低，與Western Blot實驗結(jié)果相一致。
　　6.Western Blot結(jié)果顯示，用LPS誘導的星形膠質(zhì)細胞，TLR4蛋白表達升高(P＜0.01);用bFGF處理后

8、，TLR4表達開始降低(P＜0.05)，與免疫熒光結(jié)果相一致。免疫熒光染色分析TLR4與MD2共定位情況，LPS組黃色熒光強度較對照組增強，bFGF作用組共定位黃色熒光強度減弱。
　　7.Western Blot結(jié)果顯示，LPS作用下IκBα降解導致熒光強度顯著降低，p-NFκBp65表達增加;bFGF處理后，與LPS組比較，IκBα表達增加，p-NFκ Bp65表達減少。同時免疫熒光染色結(jié)果顯示，LPS處理后，NFκBp65與核

9、完全重疊，核外周無紅色熒光分布;給與外源性bFGF處理后，NFκ Bp65紅色熒光同時分布于核內(nèi)與核周。
　　結(jié)論:
　　內(nèi)源性bFGF分泌與膠質(zhì)細胞炎癥水平密切相關，適當濃度的bFGF通過調(diào)控相關蛋白(TLR4，MD2，IκBα，p-NFκBp65)表達，抑制TLR4/NFκBp65信號途徑，從而減少促炎癥因子IL-6，TNF-α的表達和釋放，抑制星形膠質(zhì)細胞激活相關的重要蛋白（GFAP，Vimentin，Neurocan