人誘導多能干細胞來源的神經(jīng)干細胞對缺血性腦損傷的修復作用.pdf

1、研究背景與目的：
　　 誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)是一類與胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESC)具有相似全向分化潛能的干細胞，體外可分化為神經(jīng)干細胞(Neural Stem Cells，NSC)、神經(jīng)元等用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疑難疾病的細胞替代治療，臨床應用前景廣闊，有望成為干細胞移植治療的新的種子細胞來源。然而，目前人們對iPSCs向NSC分化的

2、調控機制知之甚少，要獲得數(shù)量豐富且來源穩(wěn)定的iPSCs源性的NSC用于臨床治療還存在相當?shù)募夹g困難。因此，進一步了解iPSCs向NSC定向分化的具體調控機制，對于iPSCs將來的臨床推廣應用意義重大。
　　 由于iPSCs與ESC生物學特性極其相似，而ESC的自我更新和定向分化機制又一直是生命科學領域的研究熱點和重點，這就為我們深入探討誘導iPSCs向NSC分化的調控機制提供了必要的前提和基礎。研究表明ESC的自我更新和定向分化

3、受Notch、Wnt等外部信號通路、轉錄因子、和表觀遺傳修飾等多種因素的調控。Notch通路是生物體極其重要的信號傳導通路之一，其在干細胞的增殖和分化等方面均起著重要的作用。Notch受體與配體結合激活時，干細胞就表現(xiàn)為增殖；當Notch信號通路被抑制時，干細胞就分化為功能細胞。微小RNA(microRNA，miRNA)在生物體發(fā)生發(fā)育、干細胞增殖分化和腫瘤發(fā)生發(fā)展中同樣發(fā)揮著極其重要的調控作用，在人類，microRNA能夠調控至少30

4、％的基因，一個microRNA可負調控數(shù)百個靶基因的蛋白表達，幾乎可參與調控所有的生物學過程。諸多文獻研究提示在ESC的NSC定向分化過程中，microRNA能夠調控可下調干細胞內維持其未分化狀態(tài)的基因表達水平，同時激活干細胞譜系特異性基因，從而促進ESC定向分化。
　　 然而目前尚未見iPSCs神經(jīng)定向分化相關調控機制的研究報道，為探討iPSCs向NSC定向分化的機制以及iPSCs來源的NSC對缺血性腦損傷疾病的修復效果，本課

5、題擬分為體外實驗及體內實驗兩部分：體外實驗首先將iPSCs定向分化為NSC，利用實時定量PCR、Western blot等方法檢測分化過程中各時間點Notch信號分子、miRNAs的表達變化，初步探討Notch信號分子、miRNAs與iPSCs向NSC定向分化過程的關系；體內實驗擬通過將iPSCs來源的NSC立體定向移植至大鼠中動脈栓塞模型(middle cerebral arterial occlusion，MCAO)模型中，觀察其對

6、大鼠缺血性腦損傷所致神經(jīng)功能缺陷的修復作用，為利用干細胞和再生醫(yī)學技術治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疑難疾病提供新的理論依據(jù)和技術準備。
　　 研究內容和方法：
　　 1體外實驗
　　 1.1人iPSCs的培養(yǎng)及向NSC的誘導分化：采用本課題組已建立的培養(yǎng)及分化體系培養(yǎng)人iPSC細胞并誘導其向NSC分化，應用免疫熒光染色對分化后的細胞進行NSC標志物Nestin、Sox2表達的鑒定。
　　 1.2采用實時熒光定量PCR

7、檢測分化過程中mir-9，mir-34a、mir-200b的表達，與iPS組比較，觀察mir-9，mir-34a、mir-200b的動態(tài)表達變化。
　　 1.3采用實時熒光定量PCR檢測分化過程中Notch1、Hes1的基因表達水平，與iPS組比較，觀察Notch1、Hes1基因的動態(tài)表達變化。
　　 1.4采用免疫熒光染色和Western blot法檢測誘導過程中Notch1、Hes1的蛋白表達水平，與iPS組比較，觀

8、察誘導過程中Notch1、Hes1蛋白的表達變化。
　　 1.5利用Notch信號阻斷劑DAPT進一步驗證Notch信號通路在iPSCs向NSC定向分化過程中的作用。實驗分為RA對照組，DAPT誘導組，RA+DAPT誘導組，RA+DMSO對照組；倒置顯微鏡下觀察各組細胞的形態(tài)變化，實時熒光定量PCR誘導第7天的各組細胞Nestin、β-tubulinⅢ、GFAP、Notch1和Hes1基因的表達情況，免疫熒光染色同時檢測Nest

9、in、β-tubulinⅢ、和GFAP蛋白的表達。
　　 2體內實驗
　　 2.1參考Longa法制作大腦中動脈栓塞(MCAO)模型，CM-DiI標記iPS來源的NSC進行大鼠紋狀體立體定向移植，觀察移植的NSC在大鼠腦內的存活、遷移狀況，并以免疫熒光染色法檢測神經(jīng)細胞相關標志物Nestin，β-tublinⅢ，GFAP的變化，以觀察其分化情況。同時利用平衡木行走實驗、抓握實驗及水迷宮實驗對大鼠進行神經(jīng)功能測評。

10、　　 結果：
　　 1體外實驗
　　 1.1成功將iPSCs誘導分化為NSC。iPSCs經(jīng)RA結合無血清培養(yǎng)基誘導3天后，可觀察到細胞球形成神經(jīng)rosette結構。免疫熒光染色顯示細胞球呈Nestin及Sox2陽性表達，貼壁培養(yǎng)1個月后，細胞形成神經(jīng)網(wǎng)絡狀結構，免疫熒光鑒定提示細胞高表達NSC標志物Nestin及Sox2。
　　 1.2實時熒光定量PCR結果顯示，與iPSCs組相比較，mir-9、-34a、-2

11、00b的表達水平在iPSCs的NSC定向分化過程中顯著上調。
　　 1.3實時熒光定量PCR結果顯示，在iPSCs形成EB的過程中，與iPSCs組相比較，Notch1和Hes1 mRNA的表達明顯上調，隨著RA及無血清培養(yǎng)基誘導iPSCs分化的開始，Notch1和Hes1 mRNA的表達下調。
　　 1.4免疫熒光染色結果顯示，與自然分化組比較，誘導28d后RA無血清培養(yǎng)基誘導組的Notch1以及Hes1蛋白表達的陽性細

12、胞率顯著下降，Western blot結果也顯示，在iPSCs向NSC的分化過程中，Notch1、Hes1蛋白的表達隨著RA結合無血清培養(yǎng)基誘導分化，Notch1、Hes1蛋白的表達逐漸降低，誘導分化后貼壁培養(yǎng)14d時最低，而后表達水平逐漸增高。
　　 1.5 DAPT加入后，大部分細胞球容易貼壁，細胞球周圍可見爬出細長的神經(jīng)絲樣觸角；第3d左右，貼壁的細胞球內可見大量神經(jīng)rosette結構，培養(yǎng)2W后，細胞球分化形成神經(jīng)網(wǎng)絡狀

13、結構。結合實時熒光定量PCR和免疫熒光鑒定各誘導組神經(jīng)標志物Nestin、β-tubullinⅢ及GFAP的表達結果表明，DAPT能夠促進iPSC向NSC的定向分化；與RA對照組及RA+DMSO對照組比較，加入DAPT后，iPSC向NSC的分化速度加快，同時神經(jīng)元細胞及少突膠質細胞所占分化后細胞的比例也增加，說明加入DAPT后，Notch信號被抑制，使得iPSC能夠快速的向NSC定向分化，而由于DAPT對Notch信號的抑制作用是持續(xù)的

14、，使得部分NSC繼續(xù)分化為神經(jīng)元及少突膠質細胞。
　　 2體內實驗
　　 2.1移植后iPSCs來源的NSC在大鼠腦組織內能夠長期存活，移植1周和2周后免疫熒光染色提示移植區(qū)和腦缺血區(qū)分別可見移植細胞，且細胞分別表達神經(jīng)細胞標志物β-tubulinⅢ、GFAP，表明移植后的細胞在腦組織內能夠向缺血區(qū)遷移并進一步分化為神經(jīng)細胞；分別利用抓握實驗、平衡木行走實驗及水迷宮實驗在模型制備后0，1，2，3W對各組SD大鼠進行評分，

15、與正常組比較，大鼠腦缺血損傷后各項神經(jīng)功能檢測指標均明顯降低；與對照組比較，NSC細胞移植組在移植2周后大鼠的抓握力、平衡行走能力和記憶功能均有一定程度的恢復。
　　 結論：
　　 1.RA結合無血清培養(yǎng)基誘導法能夠有效將人iPSCs定向分化為NSC；
　　 2.Notch信號通路參與了人iPSCs向NSC定向分化過程的調控；
　　 3.mir-9、-34a及mir-200b有可能通過調控Notch信號參