人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)缺血性腦損傷的修復(fù)作用.pdf

1、研究背景與目的：
　　 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)是一類與胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESC)具有相似全向分化潛能的干細(xì)胞，體外可分化為神經(jīng)干細(xì)胞(Neural Stem Cells，NSC)、神經(jīng)元等用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疑難疾病的細(xì)胞替代治療，臨床應(yīng)用前景廣闊，有望成為干細(xì)胞移植治療的新的種子細(xì)胞來(lái)源。然而，目前人們對(duì)iPSCs向NSC分化的

2、調(diào)控機(jī)制知之甚少，要獲得數(shù)量豐富且來(lái)源穩(wěn)定的iPSCs源性的NSC用于臨床治療還存在相當(dāng)?shù)募夹g(shù)困難。因此，進(jìn)一步了解iPSCs向NSC定向分化的具體調(diào)控機(jī)制，對(duì)于iPSCs將來(lái)的臨床推廣應(yīng)用意義重大。
　　 由于iPSCs與ESC生物學(xué)特性極其相似，而ESC的自我更新和定向分化機(jī)制又一直是生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和重點(diǎn)，這就為我們深入探討誘導(dǎo)iPSCs向NSC分化的調(diào)控機(jī)制提供了必要的前提和基礎(chǔ)。研究表明ESC的自我更新和定向分化

3、受Notch、Wnt等外部信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄因子、和表觀遺傳修飾等多種因素的調(diào)控。Notch通路是生物體極其重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路之一，其在干細(xì)胞的增殖和分化等方面均起著重要的作用。Notch受體與配體結(jié)合激活時(shí)，干細(xì)胞就表現(xiàn)為增殖；當(dāng)Notch信號(hào)通路被抑制時(shí)，干細(xì)胞就分化為功能細(xì)胞。微小RNA(microRNA，miRNA)在生物體發(fā)生發(fā)育、干細(xì)胞增殖分化和腫瘤發(fā)生發(fā)展中同樣發(fā)揮著極其重要的調(diào)控作用，在人類，microRNA能夠調(diào)控至少30

4、％的基因，一個(gè)microRNA可負(fù)調(diào)控?cái)?shù)百個(gè)靶基因的蛋白表達(dá)，幾乎可參與調(diào)控所有的生物學(xué)過(guò)程。諸多文獻(xiàn)研究提示在ESC的NSC定向分化過(guò)程中，microRNA能夠調(diào)控可下調(diào)干細(xì)胞內(nèi)維持其未分化狀態(tài)的基因表達(dá)水平，同時(shí)激活干細(xì)胞譜系特異性基因，從而促進(jìn)ESC定向分化。
　　 然而目前尚未見(jiàn)iPSCs神經(jīng)定向分化相關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究報(bào)道，為探討iPSCs向NSC定向分化的機(jī)制以及iPSCs來(lái)源的NSC對(duì)缺血性腦損傷疾病的修復(fù)效果，本課

5、題擬分為體外實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩部分：體外實(shí)驗(yàn)首先將iPSCs定向分化為NSC，利用實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot等方法檢測(cè)分化過(guò)程中各時(shí)間點(diǎn)Notch信號(hào)分子、miRNAs的表達(dá)變化，初步探討Notch信號(hào)分子、miRNAs與iPSCs向NSC定向分化過(guò)程的關(guān)系；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)將iPSCs來(lái)源的NSC立體定向移植至大鼠中動(dòng)脈栓塞模型(middle cerebral arterial occlusion，MCAO)模型中，觀察其對(duì)

6、大鼠缺血性腦損傷所致神經(jīng)功能缺陷的修復(fù)作用，為利用干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)技術(shù)治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疑難疾病提供新的理論依據(jù)和技術(shù)準(zhǔn)備。
　　 研究?jī)?nèi)容和方法：
　　 1體外實(shí)驗(yàn)
　　 1.1人iPSCs的培養(yǎng)及向NSC的誘導(dǎo)分化：采用本課題組已建立的培養(yǎng)及分化體系培養(yǎng)人iPSC細(xì)胞并誘導(dǎo)其向NSC分化，應(yīng)用免疫熒光染色對(duì)分化后的細(xì)胞進(jìn)行NSC標(biāo)志物Nestin、Sox2表達(dá)的鑒定。
　　 1.2采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR

7、檢測(cè)分化過(guò)程中mir-9，mir-34a、mir-200b的表達(dá)，與iPS組比較，觀察mir-9，mir-34a、mir-200b的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化。
　　 1.3采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)分化過(guò)程中Notch1、Hes1的基因表達(dá)水平，與iPS組比較，觀察Notch1、Hes1基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化。
　　 1.4采用免疫熒光染色和Western blot法檢測(cè)誘導(dǎo)過(guò)程中Notch1、Hes1的蛋白表達(dá)水平，與iPS組比較，觀

8、察誘導(dǎo)過(guò)程中Notch1、Hes1蛋白的表達(dá)變化。
　　 1.5利用Notch信號(hào)阻斷劑DAPT進(jìn)一步驗(yàn)證Notch信號(hào)通路在iPSCs向NSC定向分化過(guò)程中的作用。實(shí)驗(yàn)分為RA對(duì)照組，DAPT誘導(dǎo)組，RA+DAPT誘導(dǎo)組，RA+DMSO對(duì)照組；倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)變化，實(shí)時(shí)熒光定量PCR誘導(dǎo)第7天的各組細(xì)胞Nestin、β-tubulinⅢ、GFAP、Notch1和Hes1基因的表達(dá)情況，免疫熒光染色同時(shí)檢測(cè)Nest

9、in、β-tubulinⅢ、和GFAP蛋白的表達(dá)。
　　 2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　 2.1參考Longa法制作大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型，CM-DiI標(biāo)記iPS來(lái)源的NSC進(jìn)行大鼠紋狀體立體定向移植，觀察移植的NSC在大鼠腦內(nèi)的存活、遷移狀況，并以免疫熒光染色法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物Nestin，β-tublinⅢ，GFAP的變化，以觀察其分化情況。同時(shí)利用平衡木行走實(shí)驗(yàn)、抓握實(shí)驗(yàn)及水迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能測(cè)評(píng)。

10、　　 結(jié)果：
　　 1體外實(shí)驗(yàn)
　　 1.1成功將iPSCs誘導(dǎo)分化為NSC。iPSCs經(jīng)RA結(jié)合無(wú)血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)3天后，可觀察到細(xì)胞球形成神經(jīng)rosette結(jié)構(gòu)。免疫熒光染色顯示細(xì)胞球呈Nestin及Sox2陽(yáng)性表達(dá)，貼壁培養(yǎng)1個(gè)月后，細(xì)胞形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，免疫熒光鑒定提示細(xì)胞高表達(dá)NSC標(biāo)志物Nestin及Sox2。
　　 1.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與iPSCs組相比較，mir-9、-34a、-2

11、00b的表達(dá)水平在iPSCs的NSC定向分化過(guò)程中顯著上調(diào)。
　　 1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，在iPSCs形成EB的過(guò)程中，與iPSCs組相比較，Notch1和Hes1 mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)，隨著RA及無(wú)血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)iPSCs分化的開(kāi)始，Notch1和Hes1 mRNA的表達(dá)下調(diào)。
　　 1.4免疫熒光染色結(jié)果顯示，與自然分化組比較，誘導(dǎo)28d后RA無(wú)血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)組的Notch1以及Hes1蛋白表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)

12、胞率顯著下降，Western blot結(jié)果也顯示，在iPSCs向NSC的分化過(guò)程中，Notch1、Hes1蛋白的表達(dá)隨著RA結(jié)合無(wú)血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化，Notch1、Hes1蛋白的表達(dá)逐漸降低，誘導(dǎo)分化后貼壁培養(yǎng)14d時(shí)最低，而后表達(dá)水平逐漸增高。
　　 1.5 DAPT加入后，大部分細(xì)胞球容易貼壁，細(xì)胞球周圍可見(jiàn)爬出細(xì)長(zhǎng)的神經(jīng)絲樣觸角；第3d左右，貼壁的細(xì)胞球內(nèi)可見(jiàn)大量神經(jīng)rosette結(jié)構(gòu)，培養(yǎng)2W后，細(xì)胞球分化形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)狀

13、結(jié)構(gòu)。結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫熒光鑒定各誘導(dǎo)組神經(jīng)標(biāo)志物Nestin、β-tubullinⅢ及GFAP的表達(dá)結(jié)果表明，DAPT能夠促進(jìn)iPSC向NSC的定向分化；與RA對(duì)照組及RA+DMSO對(duì)照組比較，加入DAPT后，iPSC向NSC的分化速度加快，同時(shí)神經(jīng)元細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞所占分化后細(xì)胞的比例也增加，說(shuō)明加入DAPT后，Notch信號(hào)被抑制，使得iPSC能夠快速的向NSC定向分化，而由于DAPT對(duì)Notch信號(hào)的抑制作用是持續(xù)的

14、，使得部分NSC繼續(xù)分化為神經(jīng)元及少突膠質(zhì)細(xì)胞。
　　 2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　 2.1移植后iPSCs來(lái)源的NSC在大鼠腦組織內(nèi)能夠長(zhǎng)期存活，移植1周和2周后免疫熒光染色提示移植區(qū)和腦缺血區(qū)分別可見(jiàn)移植細(xì)胞，且細(xì)胞分別表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物β-tubulinⅢ、GFAP，表明移植后的細(xì)胞在腦組織內(nèi)能夠向缺血區(qū)遷移并進(jìn)一步分化為神經(jīng)細(xì)胞；分別利用抓握實(shí)驗(yàn)、平衡木行走實(shí)驗(yàn)及水迷宮實(shí)驗(yàn)在模型制備后0，1，2，3W對(duì)各組SD大鼠進(jìn)行評(píng)分，

15、與正常組比較，大鼠腦缺血損傷后各項(xiàng)神經(jīng)功能檢測(cè)指標(biāo)均明顯降低；與對(duì)照組比較，NSC細(xì)胞移植組在移植2周后大鼠的抓握力、平衡行走能力和記憶功能均有一定程度的恢復(fù)。
　　 結(jié)論：
　　 1.RA結(jié)合無(wú)血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)法能夠有效將人iPSCs定向分化為NSC；
　　 2.Notch信號(hào)通路參與了人iPSCs向NSC定向分化過(guò)程的調(diào)控；
　　 3.mir-9、-34a及mir-200b有可能通過(guò)調(diào)控Notch信號(hào)參