脂質微泡—雙配體紫杉醇納米粒復合物的制備及其體外生物性能評價.pdf

1、目的：超聲靶向微泡破壞(ultrasound targeted microbubble destruction，UTMD)技術是一種較具應用前景的的靶向給藥方法，通過在特定部位發(fā)射不同聲強的超聲波，致微泡在超聲作用下破裂，產(chǎn)生空化效應及微聲流、微射流、聲化學、沖擊波等反應，使細胞間隙增寬，膜通透性增加，細胞表面一過性小孔形成（聲孔效應），從而促進藥物通過血管內(nèi)皮屏障到達特定部位，提高藥物攝取。UTMD能靶向傳輸抗癌藥物，提高腫瘤局部藥物

2、濃度。該技術以微泡作為藥物載體，微泡的中心包裹氣體，實際應用中由于氣體的存在藥物包載量不夠高，且流體環(huán)境下微泡性能不穩(wěn)定，半衰期短。紫杉醇(paclitaxel，P)是抗癌藥物中應用最廣泛的藥物之一，能夠誘導和促進微管蛋白聚合及組裝，抑制腫瘤細胞的有絲分裂，從而抑制腫瘤細胞增殖。但它用于治療時的毒副作用大，主要表現(xiàn)為對骨髓的抑制，對腎臟、心臟及對神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用。紫杉醇水溶性差，為化學脂溶性，臨床應用時需以聚氧乙烯蓖麻油和酒精助溶，不

3、僅有全身毒副作用，還易產(chǎn)生過敏反應。生物大分子具有良好的生物相容性及可降解性，在腫瘤組織具有提高滲透和滯留作用的特點(enhanced permeability and retention effect，EPR效應)，其載藥量大、緩釋性好、性能穩(wěn)定，是一種較理想的增溶脂溶性抗癌藥物的載體。本課題選用具有良好水溶性、生物相容性、生物降解性、非免疫原性、無毒的天然生物大分子肝素作為藥物載體，通過功能化修飾改善其兩親性質，物理包裹疏水性抗癌藥

4、物紫杉醇，水溶性條件下自組裝形成載紫杉醇聚合物納米粒，從而提高藥物水溶性、降低原藥毒副作用并進一步提高藥物生物利用度。盡管納米粒作為藥物載體具有諸多優(yōu)勢，但由于其粒徑小，易于在靶器官/靶組織以外的器官/組織蓄積，不僅可能導致毒性作用，更降低了藥物在靶器官/靶組織局部的作用濃度?；趦煞N體系的優(yōu)勢與不足，我們擬通過生物素-親和素橋連作用將脂質超聲造影劑與載紫杉醇聚合物納米粒偶連，借助微泡爆破產(chǎn)生的生物學效應，構建一種超聲實時監(jiān)測下實現(xiàn)藥物

5、定向釋放的新型載藥系統(tǒng)。內(nèi)皮屏障和細胞膜是基因和藥物到達病變組織時遇到的主要屏障，腫瘤組織中缺乏淋巴引流導致間質壓力增高進一步阻止藥物到達腫瘤中心，這是目前腫瘤藥物化療中普遍面臨的難題。UTMD導致的聲孔效應能夠增加內(nèi)皮間隙和胞膜通透性，同時具有增效化療藥物的作用，但藥物進入細胞內(nèi)仍是隨機的，如何引導藥物主動跨越“內(nèi)膜屏障”進入靶細胞內(nèi)濃聚而不僅僅是彌散在細胞周圍或膜表面，提高藥物有效濃度，是亟待解決的問題。細胞穿膜肽(cell-pen

6、etrating peptides，CPPs)是一大類由10～30個氨基酸組成、可以攜帶多種分子主動穿越各種生物膜屏障包括血腦屏障，導入近乎所有細胞的短肽。自穿膜肽發(fā)現(xiàn)以來人們利用穿膜肽的轉運功能已將蛋白質、抗體、核酸、脂質體、顯像劑、細胞毒性藥物等多類物質導入細胞，為許多疾病分子水平的診斷、治療提供了有效手段，但普通穿膜肽缺乏靶向性制約了其進一步在體應用。葉酸(folic acid, FA)是天然存在的小分子物質，幾乎無免疫原性，葉酸

7、受體(folate receptor, FR)在包括乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等在內(nèi)的大部分惡性腫瘤組織中高度表達，而在正常組織中幾乎不表達。為此，我們將穿膜肽的主動穿膜作用與葉酸的腫瘤細胞靶向性結合，碳二亞胺法制備攜葉酸、穿膜肽雙配體的載紫杉醇納米粒，之后通過生物素-親和素橋將微泡與雙配體紫杉醇納米粒偶聯(lián)，進一步制備多功能微泡-雙配體紫杉醇納米粒復合物，借助葉酸的腫瘤靶向性、穿膜肽的穿膜作用及超聲介導下的多種生物學效應促進載藥納米粒主

8、動克服生物學屏障，最終促進腫瘤細胞內(nèi)有效藥物攝取，以期構建一種新型的具有高效藥物靶向傳輸能力的載藥系統(tǒng)。
　　 方法：⑴按摩爾比稱取一定量的DSPC、DPPE-Biot于三頸瓶中，并加入DiI染料、PEG4000、泊洛沙姆(F188)，加25 mL蒸餾水，于70℃水浴攪拌30min，放冷至室溫。把制好的脂質混懸液加入50 mL聚丙烯管內(nèi)，將剪切刀頭插至液面下，通入全氟丙烷氣體2 min，以一定的剪切速度剪切一定時間，制得包裹全氟

9、丙烷氣體的脂質微泡，分裝于西林瓶中充入全氟丙烷氣體密閉，制備得到生物素化DiI紅色熒光標記的脂質微泡。庫爾特計數(shù)儀進行粒度分析，激光共聚焦顯微鏡下觀察微泡形態(tài)、熒光分布情況。⑵取一定量的肝素鈉室溫下溶于去離子水中，加入到H+型的交換樹脂中進行離子交換后，加入一定量四丁基氫氧化銨溶液中和，凍干后得到四丁基化肝素。按摩爾比取一定量的四丁基化肝素、丁二酸酐以及催化劑量的DMAP冰浴條件下加入到DMF溶液中，待反應物完全溶解后加入一定摩爾量的三

10、乙胺，室溫反應，過夜。反應畢將反應液透析后，進行離子交換，凍干后，得到黃色粉末即為羧基化的肝素。⑶按摩爾比稱取一定量的D-生物素、NHS加入到70℃的DMF溶液中，待反應物完全溶解后，將反應液冷卻至室溫;加入催化劑量的DCC，室溫反應過夜后，過濾，收集上清液。將上清液加入到含有一定量的三乙胺、乙二胺的5mLDMF溶液中，反應約3～4h。反應液中加入過量乙醚，過濾，得到白色不溶物，即為氨基化的生物素。⑷稱取一定量的葉酸以及催化劑量的DCC

11、、NHS加入到25 mL的DMSO溶液中，50℃下避光反應5～6h，過濾，收集上清液。按摩爾比取一定量的三乙胺、乙二胺加入到上清液中，室溫，避光反應，過夜。反應畢將反應液滴加進過量乙腈，收集沉淀物。將沉淀物溶于去離子水中，調節(jié)溶液呈酸性，過濾。用無水乙醇、無水乙醚反復洗滌沉淀物，得到黃色粉末狀固體，即為氨基化的葉酸。⑸按摩爾比稱取一定量的羧基化肝素、氨基化生物素、氨基化葉酸、Tat肽以及催化劑量的EDC·HCl、NHS，并加入Orego

12、n green染料，室溫下避光反應、過夜。雙配體載體制備完后，室溫下加入一定量紫杉醇攪拌30 min后，反應液透析48 h后，得到生物素化攜葉酸、穿膜肽雙配體的Oregon green綠色熒光標記的紫杉醇納米粒。核磁共振氫譜法測定其結構，動態(tài)光散射儀測定其粒徑及電位，透射電鏡觀察其形態(tài)，紫外光譜方法測定其載藥量。⑹取一定量的生物素化DiI紅色熒光標記的脂質微泡，加入鏈親和素，洗滌純化后加入生物素化雙配體紫杉醇納米粒，冰上孵育30 min

13、，洗滌純化后即制備出脂質微泡-雙配體紫杉醇納米粒復合物。庫爾特計數(shù)儀進行粒度分析。激光共聚焦顯微鏡下觀察生物素化DiI紅色熒光標記的脂質微泡與Oregon green綠色熒光標記的雙配體紫杉醇納米粒的連接情況。用1mg/mL，2mg/mL，3mg/mL的雙配體紫杉醇納米粒與脂質微泡結合形成脂質微泡-雙配體紫杉醇納米粒復合物，低速離心去除未與微泡結合的雙配體紫杉醇納米粒，計算雙配體紫杉醇納米粒與微泡的結合率，求得脂質微泡-雙配體紫杉醇納米

14、粒復合物的載藥量。⑺用脂質微泡-雙配體紫杉醇納米粒復合物孵育葉酸受體陽性表達的人乳腺癌細胞MDA-MB-231及葉酸受體陰性表達的人肺癌細胞A549，加入脂質微泡-雙配體紫杉醇納米粒復合物后立即輔以不同的輻照聲強及輻照時間（即1.0 W/cma2，40 s;1.5 W/cm2，20 s;1.5 W/cm2，40 s;1.5 W/cm2，60 s），4h后Hochest33342染色細胞核，熒光顯微鏡下觀察不同條件輻照組Oregon gr

15、een綠色熒光標記的雙配體紫杉醇納米粒在兩種細胞內(nèi)的的分布情況。⑻為評估葉酸和Tat的作用，分別以葉酸紫杉醇納米粒，Tat紫杉醇納米粒，雙配體紫杉醇納米粒孵育MDA-MB-231細胞和A549細胞4h后，流式細胞分析儀定量分析兩種細胞紫杉醇納米粒的攝取情況。⑼分別用雙配體紫杉醇納米粒，脂質微泡-雙配體紫杉醇納米粒復合物聯(lián)合超聲輻照，脂質微泡-雙配體紫杉醇納米粒復合物無超聲輻照作用于MDA-MB-231細胞和A549細胞，孵育4h后，Ho

16、chest33342染核后，激光共聚焦顯微鏡觀察兩種細胞各組的細胞核周圍及核內(nèi)的紫杉醇納米粒分布情況。⑽采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)均以(x)±s表示。MDA-MB-231細胞和A549細胞在(1)空白微泡聯(lián)合超聲輻照，(2)小分子紫杉醇，(3)雙配體紫杉醇納米粒，(4)脂質微泡-雙配體紫杉醇納米粒復合物聯(lián)合超聲輻照條件下的細胞相對存活率的比較均采用One-Way ANOVA，方差不齊則選用近似F檢驗Welc

17、h法進行方差分析，差異性檢驗水準設為p＜0.05（雙側）。
　　 結果：①脂質微泡的理化性質:制備得到的脂質體微泡(MBs)在激光共聚焦顯微鏡下觀察分布均勻，無聚集現(xiàn)象，單個微泡外觀圓整。庫爾特計數(shù)儀測得MBs濃度約為(11.31±1.0)×108個/mL，粒徑為(2.20±0.93)μm。激光共聚焦顯微鏡下見DiI標記的脂質微泡(DiI-MBs)外殼發(fā)出明亮的紅色熒光，表明DiI標記的脂質微泡制備成功。②高效液相色譜及質譜分析

18、:合成肽Tat高效液相色譜分析主峰測定值為1559.86 Da，與理論分子量1560 Da基本相符，主峰含量約97.8％，合成成功。③雙配體紫杉醇納米粒的理化性質:動態(tài)光散射儀顯示雙配體紫杉醇納米粒的粒徑約為120-±7 nm，電位約為-35±4 mv。透射電鏡下觀察納米粒呈圓形，無明顯聚集現(xiàn)象。紫外光譜方法測定其載藥量約8.84％。④脂質微泡-雙配體紫杉醇納米粒復合物的理化性質:庫爾特計數(shù)儀測得其濃度約為(7.78±1.2)×108個

19、/mL，粒徑為(2.26±0.86)μm。激光共聚焦顯微鏡下觀察脂質微泡-雙配體紫杉醇納米粒復合物外殼發(fā)出明亮的黃色熒光，表明Oregongreen綠色熒光標記的雙配體紫杉醇納米粒與DiI紅色熒光標記的脂質微泡外殼連接成功。雙配體紫杉醇納米粒的濃度為2mg/mL時，脂質微泡-雙配體紫杉醇納米粒復合物的載藥量最高，即每108個復合物載紫杉醇的量為106.7μg。⑤熒光顯微鏡下觀察MDA-MB-231細胞在輻照聲強為1.0 W/cm2，時間

20、為40 s的條件下，Hochest33342藍色熒光染色的細胞核周圍及內(nèi)部見較多Oregon green綠色熒光標記的雙配體紫杉醇納米粒。而在其他輻照條件下細胞核周圍及內(nèi)部均見較少綠色熒光。A549細胞在輻照聲強為1.5W/cm2，時間為40 s的條件下，Hochest33342藍色熒光染色的細胞核周圍及內(nèi)部見較多Oregon green綠色熒光標記的雙配體紫杉醇納米粒。而在其他輻照條件下細胞核周圍及內(nèi)部均見較少綠色熒光。⑥分別用葉酸紫

21、杉醇納米粒，Tat紫杉醇納米粒，雙配體紫杉醇納米粒孵育MDA-MB-231細胞和A549細胞4h后，MDA-MB-231細胞在雙配體紫杉醇納米粒組攝取熒光的量最多，而A549細胞在雙配體紫杉醇納米粒組和Tat紫杉醇納米粒組攝取熒光的量基本一致。⑦分別用雙配體紫杉醇納米粒，脂質微泡-雙配體紫杉醇納米粒復合物聯(lián)合超聲輻照，脂質微泡-雙配體紫杉醇納米粒復合物無超聲輻照作用于MDA-MB-231細胞和A549細胞，4h后在同種作用條件下MDA-

22、MB-231細胞內(nèi)綠色熒光明顯強于A549細胞，且綠色熒光主要分布在MDA-MB-231細胞的細胞核內(nèi)，A549細胞的細胞質內(nèi)。以上兩種細胞內(nèi)熒光強度在脂質微泡-雙配體紫杉醇納米粒復合物聯(lián)合超聲輻照組最強，在脂質微泡-雙配體紫杉醇納米粒復合物無超聲輻照組最弱。⑧24h后MDA-MB-231細胞及A549細胞的相對存活率依次為空白微泡聯(lián)合超聲輻照組＞小分子紫杉醇組＞雙配體紫杉醇納米粒組＞脂質微泡-雙配體紫杉醇納米粒復合物聯(lián)合超聲輻照組(P

23、＜0.05)。對MDA-MB-231細胞，雙配體紫杉醇納米粒和脂質微泡-雙配體紫杉醇納米粒復合物聯(lián)合超聲輻照的半數(shù)抑制濃度分別為45.8μg/mL和17.3μg/mL;對A549細胞，雙配體紫杉醇納米粒和脂質微泡-雙配體紫杉醇納米粒復合物聯(lián)合超聲輻照的半數(shù)抑制濃度分別為50.3μg/mL和6.1μg/mL。
　　 結論：⑴成功制備脂質微泡-雙配體紫杉醇納米粒復合物。⑵不同種類細胞對促進藥物攝取的最佳輻照參數(shù)不一樣。MDA-MB-