葉酸修飾的紫杉醇長循環(huán)半固體脂質(zhì)納米粒的研究.pdf

1、許多腫瘤細(xì)胞膜表面的葉酸受體數(shù)量和活性顯著高于正常細(xì)胞,故可利用葉酸為靶標(biāo),結(jié)合載藥給藥系統(tǒng),通過與葉酸受體特異結(jié)合而將藥物靶向投遞到腫瘤組織。本文以紫杉醇為模型藥物,制備了葉酸和PEG修飾的紫杉醇半固體脂質(zhì)納米粒(Folate-PEG-SSLN)。此Folate-PEG-SSLN具有一定的長循環(huán)和腫瘤靶向作用,是較有前景的腫瘤靶向給藥系統(tǒng)。
　　 1、單甲氧基聚乙二醇一磷脂酰乙醇胺酯(MPEG-PE)的合成與表征
　　

2、 選用SC-MPEG法以TEA為催化劑活化MPEG,活化率為96.2％?；罨疨EG與PE進(jìn)行連接反應(yīng),無水乙醚沉淀得粗產(chǎn)物MPEG-PE,硅膠柱層析分離得到MPEG-PE,得率為54.9％。TLC結(jié)果顯示MPEG-PE的極性介于SC-PEG和PE之間。自制MPEG-PE的熔程為51.7～64.6℃,與標(biāo)準(zhǔn)品MPEG-PE熔程55.3～63.6℃相近。MPEG-PE的SDS-PAGE遷移率較MPEG的小,表明其分子量比MPEG有所增大。紅

3、外譜圖顯示SC-MPEG在1715cm-1處有二琥珀酰亞胺基碳酸酯的內(nèi)酰胺五元環(huán)特征峰,而MPEG-PE在該處的吸收消失,出現(xiàn)了1738cm-1處的酯鍵特征峰,表明PE的氨基取代了SC-MPEG中的琥珀酰亞胺基。1H-NMR譜圖顯示δ=5.34ppm處有SC-MPEG與PE連接反應(yīng)后產(chǎn)生的-OCONH-基團(tuán)的質(zhì)子共振峰。綜上所述,反應(yīng)合成了MPEG-PE。
　　 2、葉酸-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(Folate-PEG-PE)復(fù)合

4、物的合成與表征
　　 利用葉酸、PEG-bis-NH2和PE為原料,兩步反應(yīng)合成Folate-PEG-PE。無水乙醚沉淀得到粗產(chǎn)物,采用兩步SephadexG-25凝膠過濾層析對其進(jìn)行分離純化,凝膠譜圖表明Folate-PEG-NH2、Folate-PEG-Folate和Folate-PEG-PE分離良好。TLC結(jié)果顯示Folate-PEG-PE收集物為單一斑點,其Rf為0.85。Folate-PEG-PE的紅外譜圖在1720c

5、m-1處有明顯的酰胺酯鍵峰,而反應(yīng)物在此處皆無峰。Folate-PEG-PE的1H-NMR譜圖顯示δ=4.21ppm是葉酸分子中Glu殘基的α-CH2,δ=2.48ppm是葉酸分子中Glu殘基的β,γ-CH2,δ=3.64ppm是PEG的-OCH2CH2。Folate-PEG-PE的得率約為7.5％。
　　 3、葉酸修飾的紫杉醇長循環(huán)半固體脂質(zhì)納米粒的制備及性質(zhì)研究
　　 篩選了高溫乳化—低溫固化法制備PTX-SSLN的

6、處方和工藝。制備了Blank-SSLN、Span60-SSLN、Myrj59-SSLN、PEG-PE-SSLN和Folate-PEG-SSLN,由透射電鏡可見Span60-SSLN為多邊形,其余幾種SSLN為圓形,分散較好,且在Myrj59-SSLN、PEG-PE-SSLN和Folate-PEG-SSLN表面可見聚乙二醇“外殼”。包封率均在95％以上。Folate-PEG-SSLN和PEG-PE-SSLN的粒徑分別為207.2nm和21

7、3.3nm,而Span60-SSLN和Myrj59-SSLN的粒徑則分別約為275.5nm和236.7nm,在同樣配方和制備工藝條件下,Folate-PEG-SSLN和PEG-PE-SSLN具有更小的粒徑,可能是由于MPEG-PE具有更好的乳化作用。幾種SSLN都帶負(fù)電荷,Folate-PEG-SSLN和PEG-PE-SSLN的Zeta電位分別為-34.92mV和-37.54mV,而Span60-SSLN和Myrj59-SSLN則分別為

8、-29.21mV和-28.16mV,Folate-PEG-SSLN和PEG-PE-SSLN的Zeta電位低于Span60-SSLN和Myrj59-SSLN,可能具有更好的穩(wěn)定性。幾種納米粒的粘度都較小。
　　 4、葉酸修飾的紫杉醇長循環(huán)半固體脂質(zhì)納米粒的體外釋放及細(xì)胞攝取試驗
　　 Span60-SSLN在6d內(nèi)藥物釋放完全,在12d內(nèi)PEG-PE-SSLN和Myrj59-SSLN分別釋放85％和78％,而Folate-

9、PEG-SSLN在15d內(nèi)釋放54％。含PEG鏈的PEG-PE-SSLN、Myrj59-SSLN和Folate-PEG-SSLN較不含PEG鏈的Span60-SSLN釋藥緩慢,可能是由于PEG鏈能夠起到有效的空間位阻作用,可阻止納米粒子之間的“碰撞”,減少納米粒的聚集,減緩藥物從固體脂質(zhì)的骨架擴(kuò)散釋放。在24h內(nèi)Span60-SSLN、PEG-PE-SSLN、Myrj59-SSLN和Folate-PEG-SSLN分別釋藥43％、29.6

10、％、23.5％和10.7％,表現(xiàn)為24h內(nèi)釋放迅速,此后延遲釋藥。
　　 在30min內(nèi),Span60-SSLN、PEG-PE-SSLN和Myrj59-SSLN的MPM攝取率分別為2.31％、0.66％和0.07％。加入血漿后Span60-SSLN、PEG-PE-SSLN和Myrj59-SSLN的MPM攝取率分別為3.2％、1.62％和0.14％,這些結(jié)果表明血漿蛋白調(diào)理后促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬,而PEG鏈能在一定程度上阻止巨噬細(xì)胞

11、對納米粒的攝取。
　　 由于PEG長鏈的保護(hù),Myrj59-SSLN、PEG-PE-SSLN和Folate-PEG-SSLN體外釋放較為緩慢,具有較強(qiáng)的抵抗血漿蛋白吸附和躲避巨噬細(xì)胞吞噬的能力,預(yù)示其可能具有良好的體內(nèi)長循環(huán)特性。
　　 5、葉酸修飾的紫杉醇長循環(huán)半固體脂質(zhì)納米粒大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究
　　 建立了以地西泮為內(nèi)標(biāo)的RP-HPLC測定大鼠血漿中紫杉醇濃度的方法。大鼠尾靜脈注射Folate-PEG-S

12、SLN、PEG-PE-SSLN和Span60-SSLN,給藥后24h,Span60-SSLN組大鼠體內(nèi)藥物濃度低于檢測限,而PEG-PE-SSLN和Folate-PEG-SSLN組大鼠體內(nèi)藥物濃度分別為375ng·mL-1和258.7ng·mL-1。平均血藥濃度-時間曲線顯示含有PEG鏈的紫杉醇SSLN血中藥物濃度下降趨勢比未含PEG鏈的SSLN有所減慢。Folate-PEG-SSLN和PEG-PE-SSLN的AUC增加,體內(nèi)滯留時間M

13、RT和t1/2β延長,表明制備的Folate-PEG-SSLN和PEG-PE-SSLN具有一定長循環(huán)特性,有可能更好的靶向腫瘤部位。
　　 6、葉酸修飾的紫杉醇長循環(huán)半固體脂質(zhì)納米粒在S-180荷瘤小鼠體內(nèi)的組織分布及抑瘸率試驗
　　 在0.25h到12h內(nèi),不同時間點Folate-PEG-SSLN和PEG-PE-SSLN組在腫瘤內(nèi)的藥物分布百分率都高于溶液劑組,提示其有一定的腫瘤靶向性。在0～12h內(nèi),與溶液劑組相比,

14、Folate-PEG-SSLN組腫瘤AUC0-12提高了25％。Folate-PEG-SSLN和PEG-PE-SSLN的肺AUC分別減少86.5％和90.9％;在肝臟中的AUC分別減少36.1％和70.6％,在一定程度上減少肝巨噬細(xì)胞的吞噬;在心臟中的AUC分別減少94％和78.9％,提示Folate-PEG-SSLN和PEG-PE-SSLN可能具有降低心臟毒性的作用;在血漿中的AUC分別是溶液劑的2.47和2.33倍,表明Folate

15、-PEG-SSLN和PEG-PE-SSLN具有一定的長循環(huán)特性,有可能更多的靶向腫瘤部位。PEG-PE-SSLN和Folate-PEG-SSIN組腫瘤的相對攝取率(Re)分別為0.85和1.25,表明Folate-PEG-SSLN對腫瘤有一定靶向性。PEG-PE-SSLN和Folate-PEG-SSLN的靶向效率都小于1,表明其組織選擇性差。PEG-PE-SSLN和Folate-PEG-SSLN對紫杉醇溶液劑的腫瘤相對靶向效率分別是5.

16、26和5.77,顯示比溶液劑有更好的腫瘤靶向性,且靶向性Folate-PEG-SSLN略好于PEG-PE-SSLN。
　　 同劑量的Folate-PEG-SSLN和溶液劑的抑瘤率分別為44.38％和37.32％,Folate-PEG-SSLN組略高于溶液劑組。組織形態(tài)學(xué)觀察顯示Folate-PEG-SSLN(6mg·kg-1)能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長。
　　 7、葉酸修飾的紫杉醇長循環(huán)半固體脂質(zhì)納米粒凍干粉的制備及穩(wěn)定性

17、初步研究
　　 篩選出以5％海藻糖為凍干保護(hù)劑。以5％海藻糖為凍干保護(hù)劑時,PEG-PE-SSLN和Folate-PEG-SSLN能保持較好的形態(tài)和分散性,粒徑增大較少,Zeta電位絕對值都略有降低。DSC結(jié)果顯示,制備成SSLN后,紫杉醇以無定形態(tài)存在于SSLN中;1H-NMR也表明脂質(zhì)和藥物紫杉醇在SSLN中的結(jié)構(gòu)狀態(tài)發(fā)生了改變,具有新的熱力學(xué)性質(zhì)。穩(wěn)定性初步試驗發(fā)現(xiàn),本文制備的SSLN凍干粉宜于在4℃貯存。在4℃條件下貯存