新型紫杉醇脂質(zhì)納米粒的臨床前實驗研究.pdf

1、紫杉醇是從短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）的樹皮中分離出的新型抗腫瘤藥物，其抗腫瘤機制是通過作用于微管抑制增殖細胞的有絲分裂，導(dǎo)致細胞周期阻斷于G2/M期，快速分裂的癌細胞因出現(xiàn)生長抑制進而死亡。但因紫杉醇極難溶于水，其溶媒聚氧乙基代蓖麻油長導(dǎo)致嚴重的過敏反應(yīng)及超敏反應(yīng)。所以國內(nèi)外學(xué)者均在致力于紫杉醇的新制劑形式的研究研究。為此，本課題組研究設(shè)計將紫杉醇用生物可降解脂質(zhì)材料包裹，制備成了新型紫杉醇脂質(zhì)納米粒子（TAX—NL

2、C），具有較高的水溶性和載藥量，不含聚氧乙基代蓖麻油與無水乙醇等混合溶媒。初步的研究證實其具有較好的靶向腫瘤特征，可以迅速載帶藥物進入細胞內(nèi)，并在胞內(nèi)濃聚，對腫瘤細胞生長的抑制作用要比游離紫杉醇強，表現(xiàn)出良好的發(fā)展前景。因此有必要進一步研究其在體內(nèi)的分布和代謝特征，評價其抗腫瘤效果，為進入臨床研究作準備。 研究目的：建立放射性核素125I標記游離紫杉醇的新方法，將標記物作為示蹤劑研究新型紫杉醇脂質(zhì)納米粒子（TAX—NLC）在荷瘤

3、鼠和獼猴體內(nèi)的藥代動力學(xué)，獲得其在體內(nèi)的分布和代謝特征，并與游離紫杉醇進行對比。在此基礎(chǔ)上評價其抗腫瘤療效。 研究方法： ①改良Ch—T標記紫杉醇的方法，先用穩(wěn)定碘標記后，再用放射性碘去替代，以獲得穩(wěn)定的高放射性比活度的標記物。 ②制備包含有高放射性比活度標記物的125I標記的新型紫杉醇納米粒（125I—TAX—NLC），用于動物體內(nèi)藥代動力學(xué)研究。 ③給正常昆明小鼠單次尾靜脈注射65mg/㎡的125I—

4、TAX后的不同時間點采集靜脈血，并解剖動物獲得主要的臟器，經(jīng)過放射性核素示蹤結(jié)合TCA沉淀法獲得各樣品的藥物濃度，根據(jù)荷瘤鼠血液藥物濃度與時間的關(guān)系通過DAS2．1分析普通游離TAX的藥代動力學(xué)參數(shù)，根據(jù)各器官每克組織所含藥物量來評價普通游離TAX在體內(nèi)的分布特征。 ④給荷瘤鼠單次尾靜脈注射75mg/㎡的125I—TAX—NLC后的不同時間點采集靜脈血，并解剖動物獲得主要的臟器，經(jīng)過放射性核素示蹤結(jié)合TCA沉淀法獲得各樣品的藥物

5、濃度，根據(jù)荷瘤鼠血液藥物濃度與時間的關(guān)系通過DAS2．1分析TAX—NLC的藥代動力學(xué)參數(shù)，根據(jù)各器官每克組織所含藥物量來評價TAX—NLC在體內(nèi)的分布特征，同時用放射自顯影術(shù)直接觀察腫瘤部位的藥物蓄積。 ⑤從左前臂尾靜脈單次給獼猴注射75mg/㎡的125I—TAX—NLC，在不同時間點從右前臂靜脈采集血液，同樣經(jīng)過經(jīng)過放射性核素示蹤結(jié)合TCA沉淀法獲得各樣品的藥物濃度，根據(jù)荷瘤鼠血液藥物濃度與時間的關(guān)系，通過DAS2．1分析T

6、AX—NLC的藥代動力學(xué)參數(shù)。使用SPECT顯像對125I—TAX—NLC在獼猴的體內(nèi)分布特征進行動態(tài)觀察，并通過對各組織器官ROI的半定量分析，計算各主要臟器的藥物分布。 ⑥通過觀察荷瘤鼠用TAX—NLC治療后不同時間點腫瘤的體積變化和腫瘤重量的變化，評價TAX—NLC的抗腫瘤療效，并使用HE染色和Tunnel方法觀察腫瘤組織的死亡與凋亡率，同時體外實驗觀察新型紫杉醇納米粒（TAX—NLC）對腫瘤細胞的靶向性。 研究結(jié)

7、果：本課題在充分調(diào)研的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)開展了新型紫杉醇納米粒（TAX—NLC）在動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究，初步開展了對荷瘤鼠的治療研究，得到了以下結(jié)果： ①通過方法學(xué)研究，改良Ch—T法標記紫杉醇，標記率可達達60%以上，經(jīng)過簡單的PB液的清洗、離心沉淀純化后，標記物的放化純度達95%以上，純化后的標記產(chǎn)物在血清、乙醇中有較好的穩(wěn)定性。說明改良Ch—T法是一個合適的標記方法，標記產(chǎn)物能滿足動物體內(nèi)示蹤實驗。 ②采用放射性核素

8、標記示蹤結(jié)合TCA沉淀實驗進行紫杉醇的代謝動力學(xué)分析，是一可靠、簡便而靈敏的方法，可以將血液中新型紫杉醇納米粒（TAX—NLC）中的紫杉醇與釋放出來的游離狀態(tài)的紫杉醇一并測出，它反映的是血漿中紫杉醇的真實水平，所以更加符合實際狀況，因此得出的結(jié)果更加可靠。 游離紫杉醇在體內(nèi)的分布相半衰期0．183h，消除相半衰期為3．295小時，分布體積V1為0．887 L/㎡，清除速率CL為0．356 L/h/㎡，AUC（0—t）為172．3

9、65 mg/L*h。分布的主要器官是肺、肝、腎、脾等，其中肺部的分布呈現(xiàn)過度高的現(xiàn)象。藥物不能通過血腦屏障。 ③與游離紫杉醇比較，新型紫杉醇脂質(zhì)納米粒子（TAX—NLC）改變了藥物在體內(nèi)的分布和代謝特征，其在荷瘤鼠體內(nèi)的代謝符合三室模型，分布相半衰期延長到0．399小時，而消除相的半衰期相似，均為3—4小時；但后者出現(xiàn)了一個緩慢消除相，并且半衰期長達60天，從1室到3室的轉(zhuǎn)移速率常數(shù)K13為0．1451/h，比從3室到1室的轉(zhuǎn)移

10、速率常數(shù)K31（0．0231/h）要高得多。說明新型紫杉醇脂質(zhì)納米粒子（TAX—NLC）確實具備緩慢釋放紫杉醇的能力。兩者的V1相同，但清除速率CL有較大的變化，從0．356 L/h/㎡減少到0．137 L/h/㎡，所以AUC（0—8）182．64上升到546．135 mg/L*h。主要的分布器官是肝、脾、肺，特別是藥物能夠通過TAX—NLC的載帶，在腫瘤的部位有高度的蓄積分布，最高可達對側(cè)組織的9倍以上，并具備一定的緩釋能力，這對于未

11、來用于腫瘤的治療，具有重大的意義。 ④新型紫杉醇脂質(zhì)納米粒（TAX—NLC）在獼猴體內(nèi)的代謝動力學(xué)符合三室代謝模型，分布相半衰期分別是0．105和0．158，比其在荷瘤鼠體內(nèi)的分布相半衰期要短一倍左右；獼猴體內(nèi)的分布體積V1分別為1．422和2．678L/㎡，清除速率CL分別為0．1和0．194L/h/㎡，AUC（0—t）分別是614．105、310．473 mg/L*h，兩者相差近1倍，有較大的個體差異，比在荷瘤鼠體內(nèi)的清除速

12、率快、分布容積增加。與荷瘤鼠體內(nèi)的分布特征一樣，肝、脾、腎是主要的分布器官，但與之不同的是肺部的分布較少；未能發(fā)現(xiàn)TAX—NLC能通過血腦屏障。膽汁與尿液是主要的排泄途徑，兩者比例相當(dāng)。 ⑤TAX—NLC具有較高的載帶藥物進入細胞能力，隨著時間的延長，細胞內(nèi)TAX濃度明顯增加，大概在2小時達到飽和，細胞內(nèi)外的TAX濃度比值在25倍以上。與游離紫杉醇相比較，新型紫杉醇脂質(zhì)納米粒子（TAX—NLC）具有較好的生物適應(yīng)性，減少了普通紫

13、杉醇制劑對動物的刺激作用。兩者的抗腫瘤治療效果相當(dāng)，均可以顯著抑制腫瘤的生長，但TAX—NLC具有一定的體內(nèi)控釋作用，在停藥后，TAX—NLC在體內(nèi)可以緩慢釋放TAX，繼續(xù)發(fā)揮著抗腫瘤的作用，結(jié)果與TAX—NLC在荷瘤鼠體內(nèi)存在三室代謝模型相互吻合。 研究結(jié)論：TAX—NLC是一個有臨床應(yīng)用前景的抗腫瘤新藥系統(tǒng)。TAX—NLC在體內(nèi)具有更長的生物半衰期，能夠向腫瘤部位靶向富集，但其與一般游離紫杉醇具有相類似的抗腫瘤作用。主要的排