超聲造影劑聯(lián)合超聲輻照介導(dǎo)hsv1-tk轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜母細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一章聲諾維聯(lián)合超聲輻照HXO-44Rb細(xì)胞的安全條件
　　目的：探索超聲造影劑聲諾維(SonoVue)聯(lián)合超聲輻照HXO-44Rb細(xì)胞的安全條件。
　　方法：將培養(yǎng)好的HXO-44Rb細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，設(shè)置4組：第1組：空白對(duì)照組（HXO-44Rb細(xì)胞）；第2組：細(xì)胞+聲諾維（造影劑濃度10％、20%）；第3組：細(xì)胞+超聲輻照（輻照方案：輻照時(shí)間40 s、60 s、80 s，輻照聲強(qiáng)0.5 w

2、/cm2、1.0 w/cm2、1.5 w/cm2、2.0 w/cm2）；第4組：細(xì)胞+超聲輻照+聲諾維組（輻照方案：輻照時(shí)間40 s、60 s、80 s，輻照聲強(qiáng)0.5 w/cm2、1.0 w/cm2、1.5 w/cm2、2.0 w/cm2，造影劑濃度10%、20%）。以上各組每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別于輻照2h、24h、48 h后光鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)情況，四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT）檢測(cè)細(xì)胞存活情況。
　　結(jié)果：在

3、輻照時(shí)間為40 s、60 s、80 s，輻照聲強(qiáng)為0.5 w/cm2、1.0 w/cm2、1.5 w/cm2，造影劑濃度為10%、20%的情況下，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察時(shí)，腫瘤細(xì)胞的外形維持球形，均未發(fā)生明顯改變，仍呈片狀、團(tuán)狀聚集生長(zhǎng)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率最低（98.40±0.21）%，各組間差異無(wú)顯著性(P>0.05)；輻照時(shí)間為40 s、60 s、80 s，輻照聲強(qiáng)為2.0 w/cm2，造影劑濃度為10%、20%的情況下，腫瘤細(xì)胞外形

4、腫脹，培養(yǎng)基中可見(jiàn)細(xì)胞碎片，細(xì)胞間隙較其他組分散，MTT法檢測(cè)到細(xì)胞的存活率為（89.12±0.97）%，較其它組明顯降低(P<0.05)。
　　結(jié)論：HXO-44Rb細(xì)胞在輻照時(shí)間為40 s、60 s、80 s，輻照聲強(qiáng)為0.5 w/cm2、1.0 w/cm2、1.5 w/cm2，造影劑濃度為10%、20%條件下，各組細(xì)胞活性無(wú)明顯抑制；輻照時(shí)間為40 s、60 s、80 s，輻照聲強(qiáng)為2.0 w/cm2，造影劑濃度為10%、2

5、0%的情況下，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率為（89.12±0.97）%，較其它組明顯降低。
　　第二章 UTMD介導(dǎo)載hsv1-tk-gfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HXO-44Rb細(xì)胞實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化及結(jié)果評(píng)價(jià)
　　目的：探討超聲造影劑聲諾維(SonoVue)聯(lián)合超聲輻照介導(dǎo)載hsv1-tk-gfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HXO-44Rb細(xì)胞的可行性；對(duì)比不同輻照條件及造影劑濃度下介導(dǎo)hsv1-tk-gfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HXO-44Rb腫瘤細(xì)胞效率的差異，探索最佳轉(zhuǎn)染

6、條件。
　　方法：將培養(yǎng)好的HXO-44Rb細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，設(shè)置5組：第1組：空白對(duì)照組（HXO-44Rb細(xì)胞）；第2組：細(xì)胞+質(zhì)粒；第3組：細(xì)胞+質(zhì)粒+超聲輻照（輻照時(shí)間：40 s、60 s、80 s，輻照聲強(qiáng)：0.5 w/cm2、1.0 w/cm2、1.5 w/cm2）；第4組：細(xì)胞+質(zhì)粒+聲諾維（造影劑濃度：10%、20%）；第5組：細(xì)胞+質(zhì)粒+超聲輻照+聲諾維（輻照時(shí)間：40 s、60 s、

7、80 s，輻照聲強(qiáng)：0.5 w/cm2、1.0 w/cm2、1.5 w/cm2，造影劑濃度：10%、20%）。每組共3個(gè)復(fù)孔，質(zhì)粒用量均為1μl/孔。轉(zhuǎn)染24h,48h后于倒置熒光鏡下觀察綠色熒光分布情況；轉(zhuǎn)染48 h后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組hsv1-tk-gfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率，MTT檢測(cè)細(xì)胞存活情況。
　　結(jié)果：各組中：第4組中條件：輻照聲強(qiáng)為0.5 w/cm2、1.0 w/cm2、1.5w/cm2對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)染率分別為（3.82±1.0

8、3）%、（6.53±1.07）%,輻照條件為輻照時(shí)間60 s、輻照聲強(qiáng)1.5 w/cm2、造影劑濃度為20%下質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染率最高（14.07±0.21）%，明顯高于其它各組，差異具有顯著性（P<0.05）；MTT法檢測(cè)各組間細(xì)胞存活率在（98.40±0.21）%～（98.47±0.27）%之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：輻照時(shí)間為60 s、輻照聲強(qiáng)為1.5 w/cm2、造影劑濃度為20%的條件下hsv1-tk-g

9、fp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率最高。
　　第三章 hsv1-tk/GCV自殺基因系統(tǒng)對(duì)HXO-44Rb細(xì)胞殺傷作用及效果評(píng)價(jià)
　　目的：檢測(cè)聲造影劑聲諾維(SonoVue)聯(lián)合超聲輻照介導(dǎo)載hsv1-tk-gfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HXO-44Rb細(xì)胞后hsv1-tk/GCV自殺基因系統(tǒng)誘導(dǎo)HXO-44Rb腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。
　　方法：將培養(yǎng)好的HXO-44Rb細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，設(shè)置3組：第1組：空白對(duì)照組（HXO

10、-44Rb）；第2組：細(xì)胞+昔洛韋（昔洛韋濃度：1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、1 mg/ml）；第3組：細(xì)胞+質(zhì)粒+超聲輻照+聲諾維+昔洛韋（輻照時(shí)間：40 s、60 s、80 s，輻照聲強(qiáng)：0.5 w/cm2、1.0 w/cm2、1.5 w/cm2，造影劑濃度：10%、20%；昔洛韋濃度：1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、1 mg/ml）。細(xì)胞數(shù)量均為1×105個(gè)/孔，質(zhì)粒用量均為1μl/孔。轉(zhuǎn)染48h

11、后倒置熒光鏡下觀察細(xì)胞存活情況，轉(zhuǎn)染48 h后MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率。
　　結(jié)果：各組加入昔洛韋濃度為1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml時(shí)，細(xì)胞的存活率未見(jiàn)明顯降低；加入1 mg/ml的昔洛韋后，輻照聲強(qiáng)為0.5 w/cm2、1.0 w/cm2，HXO-44Rb細(xì)胞的存活率分別為（95.29±0.94）%、（92.58±1.29）%；在1.5 w/cm2、60 s、20%的條件下（55.26±1.21）%，較前兩組條