重組Ad-hTERTp-HSV-TK-GCV系統(tǒng)的構(gòu)建及抗肝癌實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 本課題擬構(gòu)建hTERT啟動(dòng)子調(diào)控的HSV—TK基因重組腺病毒載體系統(tǒng)，觀察Ad—hTERTp—HSV—TK/GCV系統(tǒng)對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2的殺傷作用及其過程中的旁觀者效應(yīng)，為肝癌的自殺基因靶向治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1．將穿梭質(zhì)粒pSU—Tp—TK與腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGE3共轉(zhuǎn)導(dǎo)至HEK293細(xì)胞，利用細(xì)胞內(nèi)同源重組法構(gòu)建出hTERT啟動(dòng)子調(diào)控的攜帶TK基因的復(fù)制缺陷型腺病毒Ad—hTERT

2、p—HSV—TK載體系統(tǒng)，經(jīng)PCR鑒定正確后進(jìn)行擴(kuò)增、純化及滴度測(cè)定； 2．將不同感染復(fù)數(shù)(MOI=1、10、100、1000)的重組腺病毒Ad—hTERTp—HSV—TK系統(tǒng)感染肝癌細(xì)胞HepG2及正常肝細(xì)胞L—02，加入不同濃度的GCV(0、1、10、100、1000μg/ml)，觀察Ad—hTERTp—HSV—TK對(duì)肝癌細(xì)胞生長的抑制作用及在GCV作用下TK基因的表達(dá)產(chǎn)物所致的肝癌細(xì)胞的自殺作用，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，流式

3、細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡； 3．將Ad—hTERTp—HSV—TK載體系統(tǒng)感染后的TK陽性HepG2細(xì)胞和未感染的TK陰性HepG2細(xì)胞按0、1：9、2：8、3：7、……、1混合培養(yǎng)，并分別加入100μg/ml的GCV，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，觀察其旁觀者效應(yīng)的作用。 結(jié)果： 1．穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)導(dǎo)HEK293細(xì)胞，10天后HEK293細(xì)胞中出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，提取病毒DNA，經(jīng)PCR鑒定正確并經(jīng)擴(kuò)增、純化

4、，50％組織培養(yǎng)感染劑量法(TCID50)測(cè)定病毒滴度為1.5×1010pfu/ml； 2．MTT法檢測(cè)到肝癌細(xì)胞HepG2的存活率隨著病毒MOI和GCV濃度的增加而逐漸降低，而同等條件下正常肝細(xì)胞L—02細(xì)胞的存活率無明顯改變；流式細(xì)胞儀檢測(cè)到當(dāng)病毒MOI=100，GCV濃度=100μg/ml時(shí)HepG2細(xì)胞的凋亡率可達(dá)87.02％，而L—02細(xì)胞僅為12.51％： 3．旁觀者效應(yīng)的觀察結(jié)果表明，當(dāng)TK陽性HepG2細(xì)