草莓葉片中病毒dsRNA的分離鑒定及病毒部分基因組序列分析.pdf

1、本研究旨在建立草莓病毒的dsRNA分離方法，獲得草莓主要病毒的部分基因組序列，主要結(jié)果如下： 1.利用汁液摩擦接種技術(shù)，成功地將草莓病毒從草莓栽培品種轉(zhuǎn)移到昆諾藜上，并表現(xiàn)出明顯的斑點癥狀，RT-PCR檢測確已感染SMoV和SMYEV。 2.比較不同的dsRNA提取方法，結(jié)果表明：提取過程中使用酸性酚容易使草莓組織褐化，影響提取核酸的純度和質(zhì)量，而堿性酚能夠有效地保持核酸的活性；傳統(tǒng)的SDS法提取的病毒dsRNA量很少，

2、且不易研究DNaseI、RNaseA和兩次過柱對dsRNA含量的影響；CTAB法提取的病毒dsRNA質(zhì)量較差，譜帶多呈現(xiàn)彌散狀態(tài)；本研究改進的SDS法，可以成功地從草莓病毒指示植物和栽培品種的葉片中提取出病毒dsRNA，能夠穩(wěn)定地進行瓊脂糖凝膠電泳和RT-PCR檢測及克隆測序研究。 3.比較了SYBR和EB兩種熒光染料的染色效果發(fā)現(xiàn)，SYBR的檢測靈敏性比EB至少高2倍，但SYBR染色的譜帶前移和變形明顯，不能準確地反映提取的病

3、毒dsRNA的大小。 4.從出現(xiàn)斑點癥狀的昆諾藜葉片和染病的草莓植株葉片中成功地提取了草莓病毒的dsRNA，但多次提取從昆諾藜葉片中僅獲得了1條2kb左右的dsRNA譜帶，而直接從草莓植株中提取的病毒dsRNA則主要集中在5～7kb。 5.通過提取草莓不同栽培品種、不同培養(yǎng)方式、不同葉片成熟度中的病毒dsRNA發(fā)現(xiàn)，不同草莓品種中病毒dsRNA的含量不同，試管苗葉片中dsRNA含量高于露地苗幼葉，而露地苗幼葉中dsRNA

4、含量明顯高于完全成熟葉。 6.為有效去除dsRNA提取物混雜的DNA和ssRNA，通過DNaseI和RNaseA進行酶解處理，比較了不同的酶解時間、緩沖液中鹽離子濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：dsRNA在0～0.7mol·L-1NaCl濃度下，對DNaseI均具有很強的耐性；當酶解緩沖液中含0.5mol·L-1NaCl以上時，dsRNA對RNaseA具有較強的耐性；適宜的酶解處理方法為：先進行DNaseI處理，鹽離子濃度0mol·L-1，處理

5、時間120min；經(jīng)沉淀之后再進行RNaseA處理，鹽離子濃度0.5mol·L-1，處理時間60min。 7.利用TaKaRa公司的DNA凝膠回收試劑盒，能夠有效回收凝膠中的dsRNA片段。 8.應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，從凝膠回收的dsRNA及DNaseI/RNaseA兩酶酶解處理后的dsRNA中分別擴增出SMoV和SMYEV的特異片段，得到了SMoV和SMYEV的部分基因組序列，與GenBank中對應(yīng)序列的同源性分別為9