惡性膠南瘤組織MGMT基因啟動子甲基化狀態(tài)及蛋白表達與患者臨床預后的相關性研究.pdf

1、研究背景：
　　 惡性膠質瘤（WHO分級Ⅲ級、Ⅳ級）是臨床常見的神經外科疾病，在中青年死亡原因中排名前列，因其治療的復雜性，低生存率以及近年來逐漸增高的發(fā)病率，已成為神經外科領域現(xiàn)階段研究的熱點。惡性膠質瘤存在廣泛浸潤、顱內轉移的特點，即使在手術中顯微鏡下全切腫瘤，術后短時期內仍有極高的復發(fā)率。因此術后放、化療等綜合輔助治療在膠質瘤的治療中具有很大的意義，對于改善患者生存質量，提高生存時間有很高的價值。而由于中樞神經系統(tǒng)存在血腦

2、屏障等原因，惡性膠質瘤的化療方案相對于全身其他系統(tǒng)惡性腫瘤的化療不盡相同，大部分以烷化劑為化療的基礎。
　　 06-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉移酶(O6-methylguanine-DNA-methyltransferaseMGMT)是哺乳動物機體中都存在的一種DNA烷基化損傷修復酶，它同時發(fā)揮轉移酶與甲基接受體的作用，將烷化基團從06-MG（06-甲基鳥嘌呤）的六位氧轉到自身的半膚氨酸殘基上，使DNA鏈上的鳥嘌呤損傷修復，阻止

3、DNA交聯(lián)形成。因此MGMT可抵消烷化劑對腫瘤細胞造成的DNA烷基化毒性作用，因此在腫瘤化療的眾多耐藥因素中，起到重要作用。
　　 在膠質瘤烷化劑化療中，MGMT活性被視為提示患者預后的一個極其重要的分子指標，在研究者間具有廣泛的共識，MGMT活性高，則烷化劑化療耐藥性強，患者生存期預后差。反之則預示好的預后。
　　 MGMT活性可通過MGMT的DNA、RNA、蛋白等各個層面的各種檢測方法進行研究。因RNA提純難度高，降

4、解快等特點，在RNA層面進行的MGMT研究較少，難以形成綜合分析。
　　 免疫組化法檢測的MGMT蛋白表達在過去被一致認為是烷化劑耐藥、患者生存期預后的高度可信分子預測指標，但是在近年來受到大量分析研究結果的挑戰(zhàn)，認為IHC法檢測的MGMT蛋白表達與同組標本組織啟動子甲基化狀態(tài)以及患者預后一致性差，尤其是其中一些META分析和多中心大樣本研究對MGMT蛋白表達作為預后指標的質疑有一定的說服力。
　　 近些年來的研究證實腫

5、瘤的發(fā)生與表觀遺傳學的改變有關。表觀遺傳學研究非基因序列改變所致的可遺傳的基因表達水平的變化，基因啟動子區(qū)CpG島局部甲基化水平異常升高是屬于表觀遺傳學改變的一種，可導致相關基因不表達，蛋白水平下降。使得腫瘤細胞耐藥性降低，患者獲得更好的預后。MGMT基因啟動子甲基化狀態(tài)作為烷化劑耐藥、患者生存期預后指標，在近幾年得到了廣泛的認可。
　　 以往甲基化特異性的PCR(MSP)法作為大多數(shù)研究中檢測啟動子甲基化狀態(tài)的首選方法，目前由

6、于不能做定量分析等缺陷，該方法受到各種質疑，新研究的啟動子甲基化檢測方法中，可行甲基化狀態(tài)的定量、半定量分析，各有優(yōu)缺點。其中甲基化特異性-多重連接依賴性探針擴增技術(Methylation-specificmultiplexligation-dependentprobeamplification，MS-MLPA)由MLPA技術發(fā)展而來，是一種將探針雜交與PCR擴增相結合的基因甲基化檢測技術。相比經典的MSP法，MS-MLPA法有明顯的

7、優(yōu)勢:所需檢測樣本量小;可省略亞硫酸氫鹽轉化步驟;同一引物對擴增所有探針增加了可靠性;可得到半定量的甲基化結果?？捎糜贔FPE等局部降解的DNA;分辨率高，可以同時獲得基因拷貝數(shù)信息等。是一種值得信賴的檢驗方法。
　　 本研究選用的MS-MLPAME011-B1MMR試劑盒檢測MGMT甲基化狀態(tài)，大致實驗步驟為:首先變性反應使靶序列成為為單鏈。隨后雜交反應中，長、短探針中的雜交序列與單鏈靶序列雜交互補。MS-MLPA在雜交反應后

8、分兩部分進行。一半同常規(guī)MLPA的后續(xù)連接、擴增、電泳反應，提供拷貝數(shù)信息。另一半反應要在MLPA的連接反應步驟中同時加入甲基化敏感性限制性內切酶Hha1處理，以提供甲基化狀態(tài)信息。在連接反應中同時加入Hha1內切酶，若靶序列的GCGC位點非甲基化，探針被連接的同時將被Hha1消化，不能在后續(xù)的PCR反應中被擴增;若GCGC位點是甲基化的，探針不會被Hha1消化，連接后的完整探針通過通用引物由PCR反應擴增，最終通過電泳分離，產生電泳峰

9、值信號。信號數(shù)據經一系列校正和評估后，用計算機軟件來計算，得出該序列的甲基化系數(shù)。
　　 目的：
　　 研究MGMT基因啟動子過甲基化狀態(tài)、MGMT基因拷貝數(shù)、MGMT蛋白表達與患者生存預后關系以及與患者年齡、性別、病理分級等臨床特點的關系，探討MS-MLPA法檢測基因甲基化狀態(tài)的優(yōu)勢和不足，研究IHC法檢測蛋白表達存在的各種問題，為MGMT活性高的膠質瘤術后綜合治療作出參考。
　　 研究方法：
　　 實

10、驗標本:所有腦膠質瘤石蠟標本來自南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院病理科，所有非腫瘤性對照標本取自南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院神經外科手術。
　　 觀察對象:選擇自2006至2010年間在南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院神經外科治療、術后病理證實為腦惡性膠質細胞瘤（按WHOⅢ級、Ⅳ級）患者39例，其中男性24例，女性15例，年齡20-68歲，平均46.9歲，病理分級WHOⅢ級19人，WHOⅣ級20人。所有患者均于術后放療加TMZ（替莫唑胺）化療。同時選用6例非腫

11、瘤性腦組織標本做為對照組。
　　 觀察方法:追蹤病人的總生存時間(OS)。以免疫組化法檢測膠質瘤組織MGMT蛋白表達，以MS-MLPA法檢測MGMT基因啟動子甲基化以及基因拷貝數(shù)狀態(tài)。將患者按MGMT蛋白表達情況、MGMT基因啟動子甲基化以及基因拷貝數(shù)狀態(tài)分組，評價三者與患者生存期的關系。并觀察MGMT蛋白表達以及MGMT啟動子甲基化狀態(tài)與患者年齡、性別、病理分級之間的關系。
　　 統(tǒng)計學方法:數(shù)據采用SPSS13.0統(tǒng)

12、計軟件分析。探討MGMT蛋白表達、甲基化狀態(tài)、拷貝數(shù)與生存期的關系用Kaplan—Meier法，生存時間表示為均數(shù)(±)標準誤。整體比較采用Log—Rank檢驗并繪制生存曲線圖，若整體比較存在統(tǒng)計學差異則進一步進行組間多重比較。分析MGMT蛋白表達情況與MGMT啟動子甲基化狀態(tài)之間相關性采用Spearman相關系數(shù);MGMT蛋白表達情況以及MGMT啟動子甲基化狀態(tài)分別與患者年齡、性別、病理分級之間的關系用x2檢驗進行統(tǒng)計分析。當P＜0.

13、05時差異有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗步驟:對膠質瘤石蠟標本行免疫組化染色，DAB法顯色。陽性對照為已知的MGMT陽性的膠質瘤組織。PBS液代替一抗作為陰性對照。結果判斷:MGMT陽性染色定位于細胞核或細胞漿，呈棕黃色。按MGMT表達情況分成三級:無任何MGMT陽性表達者及MGMT陽性細胞數(shù)＜10％為陰性（一）;陽性細胞數(shù)10％-30％為弱陽性(+);＞30％陽性細胞數(shù)為強陽性(++)。以MS-MLPA法檢測石蠟標本MGMT基因啟

14、動子甲基化，選擇6份非腫瘤性人腦石蠟包埋組織作為參考樣本，并設置一個以蒸餾水代替樣本DNA的無DNA陰性對照反應。首先用凱杰QIAAMPDNAFFPETISSUE試劑盒提取石蠟包埋組織的基因組DNA并檢測濃度(50ng/ul)。按照DNA變性、雜交、連接、PCR擴增和電泳分離檢測的順序行MS-MLPA檢測，電泳數(shù)據經相應的軟件分析，計算出的拷貝數(shù)系數(shù)和甲基化率。結果判斷:拷貝數(shù)系數(shù)0.8-1.2者為正常，MGMT拷貝數(shù)系數(shù)＜0.8者視為

15、拷貝數(shù)缺失;拷貝數(shù)系數(shù)＞1.2者視為拷貝數(shù)增多。MGMT探針甲基化比率＜0.25，即樣本未甲基化;0.25＜甲基化率＜0.5，即樣本低度過甲基化;0.5＜甲基化率＜0.75，即樣本中度過甲基化。甲基化率＞0.75，即樣本高度過甲基化。
　　 結果:
　　 1、蛋白表達與患者OS（總生存期）關系:(1)若將標本分為MGMT—、MGMT+、MGMT++三組蛋白表達，觀察與患者總生存期的關系，MGMT—組與MGMT++組生存時

16、間存在統(tǒng)計學差異(P=0.001)，其他組間生存時間無統(tǒng)計學差異。(2)若將標本分為MGMT—、MGMT+/++兩組蛋白表達觀察，組間生存時間存在統(tǒng)計學差異(P=0.003)。
　　 2基因啟動子甲基化狀態(tài)與患者OS關系:未甲基化、低度過甲基化、中度過甲基化、高度過甲基化四組生存時間均存在顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.001)。拷貝數(shù)狀態(tài)與患者OS關系:拷貝數(shù)缺失、拷貝數(shù)正常、拷貝數(shù)增多3組間生存時間整體比較無統(tǒng)計學差異(P=0.93

17、8)。
　　 3、男女兩組組患者之間、≥50歲和＜50歲兩組患者之間、WHOⅢ級和Ⅳ兩組患者之間的MGMT蛋白表達差異都沒有統(tǒng)計學意義。男女兩組組患者之間、≥50歲和＜50歲兩組患者之間、WHOⅢ級和Ⅳ兩組患者之間的甲基化狀態(tài)差異也都沒有統(tǒng)計學意義。
　　 4、惡性膠質瘤組織MGMT蛋白表達與MGMT基因啟動子甲基化狀態(tài)存在統(tǒng)計學相關性，Spearman秩相關系數(shù)為0.697(P＜0.001)。
　　 結論:

18、r>　　 1、MS-MLPA法檢測MGMT基因啟動子甲基化狀態(tài)是一種可靠的方法。相比經典的MSP法，MS-MLPA法具有優(yōu)勢。
　　 2、惡性膠質瘤組織MGMT基因啟動子甲基化狀態(tài)與患者生存期存在顯著相關性，甲基化率越高者預后越好。與患者年齡、性別、病理分級無相關性。惡性膠質瘤組織基因拷貝數(shù)狀態(tài)與患者生存預后無相關性。
　　 3、惡性膠質瘤組織MGMT表達與患者生存預后存在相關性，表達陽性者比表達陰性者生存率更低。IH