胃癌組織中MGMT、RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化研究.pdf

1、目的:本研究在檢測(cè)胃癌及癌旁正常組織的基礎(chǔ)上，探討MGMT（6-氧-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶）以及RASSF1A（RAS相關(guān)區(qū)域家族1A）基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的狀況，分析胃癌及癌旁正常組織中兩組基因的甲基化改變情況，主要分析在胃癌產(chǎn)生、進(jìn)展中MGMT和RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化狀況的作用。胃癌是一類普遍的消化道惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)死亡率在全部惡性腫瘤中占據(jù)第二位。多階段變異、多基因累積產(chǎn)生的異常狀態(tài)是類似胃癌和其他惡性腫瘤的發(fā)生

2、基礎(chǔ)。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因、DNA錯(cuò)配修復(fù)基因和腫瘤抑制基因等是胃癌中產(chǎn)生多種因DNA甲基化而失活的基因。
　　方法:
　　(1)收集青島市市立醫(yī)院2012年至2013年手術(shù)切除的，經(jīng)病理檢查證實(shí)的胃癌標(biāo)本60例，癌旁正常組織取自相應(yīng)距腫瘤邊緣5cm以上的黏膜60例。分別提取DNA，將提取的DNA進(jìn)行亞硫酸鈉修飾，將最后修飾的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過甲基特異性聚合酶擴(kuò)增鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(methylation specific PCR

3、，MSP)檢測(cè)胃癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織MGMT、RASSF1A基因啟動(dòng)子的甲基化狀況。綜合分析兩個(gè)基因的甲基化與胃癌發(fā)生的關(guān)系。
　　(2)分別提取60例胃癌組織與癌旁正常組織的RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，繼而進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-多聚合酶鏈反應(yīng)(real-time RT-PCR)檢測(cè)基因MGMT、RASSF1A的mRNA表達(dá)情況。
　　(3)取胃癌組織、癌旁正常組織，用免疫組織化學(xué)方法分析MGMT及RAS

4、SF1A基因的表達(dá)情況，同時(shí)探討它們與胃癌發(fā)生的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料的比較采用x2檢驗(yàn)，組間應(yīng)用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析;以P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　(1)通過甲基特異性聚合酶擴(kuò)增鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(methylation specific PCR, MSP)檢測(cè)胃癌組織MGMT啟動(dòng)子區(qū)甲基化率為45.00％(27/60)明顯高于正常組織8.33％(5/60)，胃癌組織RA

5、SSF1A啟動(dòng)子區(qū)甲基化率為64.70％(37/60)明顯高于正常組織6.67％(4/60)，胃癌組織中MGMT、RASSF1A基因的甲基化陽(yáng)性率較正常組織明顯升高(P＜0.05)。
　　(2)通過實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-多聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)胃癌組織中MGMTmRNA表達(dá)陽(yáng)性率為38.3％(23/60)明顯低于正常組織96.67％(58/60)，胃癌組織中RASSF1AmRNA表達(dá)陽(yáng)性率為20.00％(12/60)明顯低于正常組織100

6、％(60/60)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(3)通過免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)MGMT蛋白表達(dá)在胃癌組織的31.61％(19/60)明顯低于癌旁正常組織中的陽(yáng)性率為90.00％(54/60)，RASSF1A在胃癌組織的30.00％(18/60)明顯低于癌旁正常組織中的陽(yáng)性率為91.67％(55/60)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)用甲基特異性聚合酶擴(kuò)增鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)