腫瘤肽特異性的同種CD4+T細(xì)胞的誘導(dǎo)及其對(duì)荷瘤裸鼠抗瘤作用的研究.pdf

1、T細(xì)胞在同種移植物排斥反應(yīng)和移植物抗宿主病中起主要作用，CD4+和CD8+T細(xì)胞都參與了這些反應(yīng)。T細(xì)胞TCR識(shí)別的配體是抗原肽和MHC I或MHC II分子形成的復(fù)合物（pMHC），分別被CD8+和CD4+T細(xì)胞識(shí)別。急性排斥反應(yīng)中T細(xì)胞對(duì)同種抗原的直接識(shí)別起主要作用。研究表明T細(xì)胞識(shí)別抗原肽/同種MHC復(fù)合物和抗原肽/自身MHC復(fù)合物一樣通常也是pMHC特異性的，并且TCR和同種MHC分子的相互作用方式與傳統(tǒng)的自身MHC分子提呈抗原

2、肽給TCR識(shí)別是一樣的?？乖奶禺愋缘牡耐N反應(yīng)性T細(xì)胞被稱為同種限制性T細(xì)胞。已有研究證實(shí)是CD4+而非CD8+T細(xì)胞在同種排斥反應(yīng)中起本質(zhì)作用：一方面CD4+T可以輔助其他淋巴細(xì)胞參加免疫反應(yīng)，另一方面它本身也是移植物排斥反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞。同時(shí)，臨床資料顯示移植物抗白血病反應(yīng)(GVLR)使白血病病人的病情得以緩解，并且移植物抗腫瘤反應(yīng)(GVTR)在許多實(shí)體瘤的病例中也得到證實(shí)，這是由于供者T淋巴細(xì)胞對(duì)宿主的白血病細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞發(fā)生了免

3、疫反應(yīng)。盡管許多研究都集中于CD8+T細(xì)胞在GVLR 或者GVTR中的作用并且發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞在其中發(fā)揮效應(yīng)作用，但實(shí)際上在GVLR中需要CD4+T和CD8+T細(xì)胞兩者共同參與。由于CD4+T細(xì)胞在普通免疫反應(yīng)和同種反應(yīng)中均發(fā)揮重要作用，我們認(rèn)為同種反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞尤其是同種限制性CD4+T細(xì)胞可能在GVLR或者GVTR中起重要作用。本研究目的是要建立一個(gè)誘生同種限制性CD4+T細(xì)胞的方法并且觀察這種CD4+T細(xì)胞的腫瘤排斥效應(yīng)。

4、
　　 本研究先制備出腫瘤抗原肽/HLA-DR15/IgG1-Fc二聚體，再將結(jié)合了此二聚體的HLA-DR15陰性的單核細(xì)胞和自體的外周血淋巴細(xì)胞（PBL）共培養(yǎng)誘導(dǎo)出腫瘤肽特異性的同種CD4+T細(xì)胞，并將此細(xì)胞過繼到荷瘤裸鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其可以明顯抑制荷瘤裸鼠體內(nèi)的腫瘤生長，延長其生存期。論文共分為三部分，其主要內(nèi)容與結(jié)果如下：
　　 一、制備HLA-DR15/IgG1-Fc二聚體，并且該二聚體能有效結(jié)合到HLA-DR15

5、陰性（DR15-ve）個(gè)體的單核細(xì)胞表面
　　 采用RT-PCR方法從人宮頸癌細(xì)胞系SiHa(為HLA-DR15基因型)中擴(kuò)增DRα鏈和DRβ鏈的信號(hào)肽及胞外序列以及轉(zhuǎn)錄因子Fos和Jun的亮氨酸拉鏈序列，將擴(kuò)增的DRα段和DRβ段分別和轉(zhuǎn)錄因子Fos和Jun的亮氨酸拉鏈區(qū)連接形成DRα-Fos和DRβ-Jun，再將DRα-Fos和人IgG1的Fc段相連，構(gòu)建出重組載體pFastBacTMDual+[DR15/IgG1-Fc]。

6、將此載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10BacTM，得到重組的穿梭質(zhì)粒Bacmid+[DR15/IgG1-Fc]，將此穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)入昆蟲細(xì)胞Sf9中，收獲上清得到成熟病毒顆粒，再用此病毒顆粒大量感染Sf9細(xì)胞，收集病毒感染的Sf9細(xì)胞培養(yǎng)上清，通過葡萄球菌蛋白A（SPA）柱純化得到可溶性DR15/IgG1-Fc二聚體融合蛋白（簡稱DR15二聚體）。ELISA和Western-blotting檢測均證實(shí)DR15二聚體產(chǎn)物由兩部分組成：二聚化的DR15的

7、胞外段提供有效的TCR反應(yīng)部分，IgG1-Fc段能與單核細(xì)胞表面高親和力受體FcγRI結(jié)合。
　　 將純化的DR15二聚體與DR15-ve個(gè)體的單核細(xì)胞孵育，用流式細(xì)胞術(shù)檢測具有HLA-DR15陽性表型的單核細(xì)胞百分?jǐn)?shù)以確定二聚體與DR15-ve單核細(xì)胞的結(jié)合能力。流式分析結(jié)果顯示DR15-ve單核細(xì)胞結(jié)合DR15二聚體后大多數(shù)具有HLA-DR15陽性表型，說明DR15二聚體可以有效結(jié)合到DR15-ve單核細(xì)胞表面。
　　

8、 二、結(jié)合了抗原肽/HLA-DR15/IgG1-Fc二聚體的單核細(xì)胞誘導(dǎo)肽特異性的同種CD4+T細(xì)胞的產(chǎn)生
　　 為誘導(dǎo)抗原肽特異性的同種CD4+T細(xì)胞，本研究建立了一個(gè)共培養(yǎng)體系：純化的DR15二聚體加載其限制性肽后結(jié)合到酸洗過的DR15-ve個(gè)體的單核細(xì)胞表面，形成共培養(yǎng)體系中的刺激細(xì)胞；同一個(gè)體來源的外周血淋巴細(xì)胞(PBLs)作為共培養(yǎng)體系中的效應(yīng)細(xì)胞。共培養(yǎng)7 d后，通過CFSE稀釋法由流式細(xì)胞儀檢測到共培養(yǎng)體系中的C

9、D4+T細(xì)胞發(fā)生了明顯的增殖。再次用同樣方法進(jìn)行二次刺激,7 d后，該體系中淋巴細(xì)胞的特異性肽/DR15二聚體染色陽性細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照，且誘導(dǎo)出的特異性肽/DR15二聚體陽性的CD4+T細(xì)胞能特異性的分泌細(xì)胞因子IFN-γ，這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)本研究所誘導(dǎo)的同種CD4+T細(xì)胞具有pMHC特異性。
　　 三、腫瘤肽特異性的同種CD4+T細(xì)胞能有效抑制荷瘤裸鼠的腫瘤生長
　　 人宮頸鱗癌細(xì)胞SiHa是HLA-DR15基因型且高表達(dá)

10、E7蛋白，可以作為本研究誘導(dǎo)的E7肽特異性的同種CD4+T的靶細(xì)胞。將經(jīng)過二次刺激的淋巴細(xì)胞通過磁珠陰性分選得到較純的肽特異的同種CD4+T細(xì)胞，再將其過繼到荷SiHa瘤細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)過繼腫瘤抗原肽特異性的同種CD4+T細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)的腫瘤生長受到抑制，其生存期與對(duì)照組相比顯著延長。免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)在特異性組有明顯的人CD4+細(xì)胞浸潤，而對(duì)照組不明顯。
　　 總之，本研究通過將DR15-ve的淋巴細(xì)胞和結(jié)合了肽/DR1